Hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques humaines au-delà de la chaîne lourde de myosine

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Le muscle squelettique est un tissu hétérogène composé principalement de myofibrilles, généralement classées chez l'humain en trois types : un type « lent » (type 1) et deux types « rapides » (types 2A et 2X). Cependant, l'hétérogénéité entre et au sein de ces types de myofibrilles reste mal comprise. Nous avons appliqué des approches transcriptomiques et protéomiques à 1 050 et 1 038 myofibrilles individuelles du vaste latéral humain, respectivement. L'étude protéomique a porté sur des hommes, et l'étude transcriptomique sur 10 hommes et 2 femmes. Outre les isoformes de la chaîne lourde de myosine, nous avons identifié des protéines métaboliques, des protéines ribosomiques et des protéines de jonction cellulaire comme sources de variabilité intermyofibrillaire multidimensionnelle. De plus, malgré l'identification de groupes de fibres lentes et rapides, nos données suggèrent que les fibres de type 2X sont phénotypiquement indiscernables des autres fibres à contraction rapide. De plus, la classification basée sur la chaîne lourde de myosine est insuffisante pour décrire le phénotype des myofibres dans les myopathies à bâtonnets. Globalement, nos données suggèrent une hétérogénéité multidimensionnelle des myofibres, avec des sources de variation qui dépassent le cadre des isoformes de la chaîne lourde de myosine.
L'hétérogénéité cellulaire est une caractéristique inhérente à tous les systèmes biologiques, permettant aux cellules de se spécialiser pour répondre aux différents besoins des tissus et des cellules.¹ La conception traditionnelle de l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques postule que les motoneurones définissent le type de fibre au sein d'une unité motrice, et que ce type (par exemple, type 1, type 2A et type 2X chez l'humain) est déterminé par les caractéristiques des isoformes de la chaîne lourde de myosine (MYH).² Cette conception reposait initialement sur leur instabilité ATPase au pH,^3,4 puis sur leur expression moléculaire de la MYH.⁵ Cependant, avec l'identification et l'acceptation subséquente des fibres « mixtes » co-exprimant plusieurs MYH en proportions variables, les fibres musculaires squelettiques sont de plus en plus perçues comme un continuum plutôt que comme des types de fibres distincts.⁶ Malgré cela, le domaine s'appuie encore fortement sur la MYH comme principal critère de classification des myofibres, une vision probablement influencée par les limitations et les biais importants des premières études chez les rongeurs, dont les profils d'expression de la MYH et la gamme de types de fibres diffèrent de ceux observés chez l'humain.² La situation est encore compliquée par le fait que différents muscles squelettiques humains présentent une grande diversité de types de fibres.7 Le vaste latéral est un muscle mixte avec un profil d'expression MYH intermédiaire (et donc représentatif).7 De plus, sa facilité d'échantillonnage en fait le muscle le mieux étudié chez l'homme.
Ainsi, l'étude objective de la diversité des fibres musculaires squelettiques à l'aide d'outils « omiques » performants est essentielle mais complexe, notamment en raison de la nature multinucléée de ces fibres. Cependant, les technologies de transcriptomique^8,9 et de protéomique¹⁰ ont connu une révolution en termes de sensibilité ces dernières années grâce à diverses avancées technologiques, permettant l'analyse du muscle squelettique à l'échelle de la fibre unique. De ce fait, des progrès significatifs ont été réalisés dans la caractérisation de la diversité des fibres individuelles et de leur réponse aux stimuli atrophiques et au vieillissement^{11,12,13,14,15,16,17,18}. Surtout, ces avancées technologiques ont des applications cliniques, permettant une caractérisation plus détaillée et précise des dérèglements associés aux maladies. Par exemple, la physiopathologie de la myopathie à bâtonnets, l'une des maladies musculaires héréditaires les plus fréquentes (MIM 605355 et MIM 161800), est complexe et difficile à comprendre.19,20 Par conséquent, une meilleure caractérisation de la dysrégulation des fibres musculaires squelettiques pourrait conduire à des progrès significatifs dans notre compréhension de cette maladie.
Nous avons mis au point des méthodes d'analyse transcriptomique et protéomique de fibres musculaires squelettiques isolées manuellement à partir de biopsies humaines et les avons appliquées à des milliers de fibres, ce qui nous a permis d'étudier l'hétérogénéité cellulaire des fibres musculaires squelettiques humaines. Au cours de ces travaux, nous avons démontré la puissance du phénotypage transcriptomique et protéomique des fibres musculaires et identifié des protéines métaboliques, ribosomiques et de jonction cellulaire comme sources importantes de variabilité interfibre. De plus, grâce à ce flux de travail protéomique, nous avons caractérisé la pertinence clinique de la myopathie à nématodes dans des fibres musculaires squelettiques individuelles, révélant une transition coordonnée vers des fibres non oxydatives, indépendamment du type de fibre, selon l'expression de MYH.
Afin d'étudier l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques humaines, nous avons développé deux protocoles permettant l'analyse du transcriptome et du protéome de fibres musculaires squelettiques individuelles (Figure 1A et Figure supplémentaire 1A). Nous avons développé et optimisé plusieurs étapes méthodologiques, depuis le stockage des échantillons et la préservation de l'intégrité de l'ARN et des protéines jusqu'à l'optimisation du débit pour chaque approche. Pour l'analyse du transcriptome, nous avons inséré des codes-barres moléculaires spécifiques à chaque échantillon dès l'étape initiale de la transcription inverse, ce qui a permis de regrouper 96 fibres pour un traitement ultérieur efficace. Un séquençage plus profond (environ 1 million de lectures par fibre) par rapport aux approches unicellulaires classiques a permis d'enrichir davantage les données transcriptomiques.²¹ Pour la protéomique, nous avons utilisé un gradient chromatographique court (21 minutes) combiné à l'acquisition de données DIA-PASEF sur un spectromètre de masse timsTOF afin d'optimiser la profondeur du protéome tout en maintenant un débit élevé. 22,23 Afin d'étudier l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques saines, nous avons caractérisé les transcriptomes de 1 050 fibres individuelles provenant de 14 donneurs adultes sains et les protéomes de 1 038 fibres provenant de 5 donneurs adultes sains (Tableau supplémentaire 1). Dans cet article, ces jeux de données sont désignés respectivement par les termes « transcriptomes et protéomes des 1 000 fibres ». Notre approche a permis de détecter un total de 27 237 transcrits et 2 983 protéines dans les analyses transcriptomiques et protéomiques des 1 000 fibres (Figure 1A, Données supplémentaires 1 et 2). Après filtrage des jeux de données transcriptomiques et protéomiques pour retenir plus de 1 000 gènes détectés et 50 % de valeurs valides par fibre, des analyses bioinformatiques complémentaires ont été réalisées sur 925 fibres du transcriptome et 974 fibres du protéome. Après filtrage, en moyenne 4 257 ± 1 557 gènes et 2 015 ± 234 protéines (moyenne ± écart-type) ont été détectés par fibre, avec une variabilité interindividuelle limitée (Figures supplémentaires 1B et 1C, Données supplémentaires 3 et 4). Cependant, la variabilité intra-individuelle était plus marquée entre les participants, probablement en raison des différences de rendement en ARN/protéines entre les fibres de longueurs et de sections transversales différentes. Pour la plupart des protéines (> 2 000), le coefficient de variation était inférieur à 20 % (Figure supplémentaire 1D). Les deux méthodes ont permis de capturer une large gamme dynamique de transcrits et de protéines présentant des signatures d’expression élevées importantes pour la contraction musculaire (par exemple, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figures supplémentaires 1E et 1F). La plupart des caractéristiques identifiées étaient communes entre les ensembles de données transcriptomiques et protéomiques (Figure supplémentaire 1G), et les intensités moyennes UMI/LFQ de ces caractéristiques étaient raisonnablement bien corrélées (r = 0,52) (Figure supplémentaire 1H).
Flux de travail transcriptomique et protéomique (créé avec BioRender.com). BD Courbes de gamme dynamique pour MYH7, MYH2 et MYH1, et seuils calculés pour l'attribution du type de fibre. E, F Distribution de l'expression de MYH dans les fibres des jeux de données transcriptomiques et protéomiques. G, H Représentations UMAP (Uniform Diversity Approximation and Projection) pour la transcriptomique et la protéomique, colorées selon le type de fibre basé sur MYH. I, J Graphiques de caractéristiques montrant l'expression de MYH7, MYH2 et MYH1 dans les jeux de données transcriptomiques et protéomiques.
Nous avons initialement entrepris d'attribuer un type de fibre à chaque fibre en fonction de l'expression de MYH, grâce à une approche optimisée tirant parti de la haute sensibilité et de la large gamme dynamique de cette expression dans les données omiques. Des études antérieures ont utilisé des seuils arbitraires pour classer les fibres comme étant de type 1 pur, de type 2A, de type 2X ou mixtes, selon un pourcentage fixe d'expression des différents MYH^11,14,24. Nous avons utilisé une approche différente, dans laquelle l'expression de chaque fibre a été classée selon les MYH utilisés pour son typage : MYH7, MYH2 et MYH1, correspondant respectivement aux fibres de type 1, 2A et 2X. Nous avons ensuite calculé mathématiquement le point d'inflexion inférieur de chaque courbe résultante et l'avons utilisé comme seuil pour classer les fibres comme positives (au-dessus du seuil) ou négatives (en dessous du seuil) pour chaque MYH (Figure 1B–D). Ces données démontrent que MYH7 (Figure 1B) et MYH2 (Figure 1C) présentent des profils d'expression (activation/inhibition) plus distincts au niveau de l'ARN qu'au niveau protéique. En effet, au niveau protéique, très peu de fibres n'exprimaient pas MYH7, et aucune fibre n'exprimait MYH2 à 100 %. Nous avons ensuite utilisé des seuils d'expression prédéterminés pour attribuer des types de fibres basés sur MYH à toutes les fibres de chaque jeu de données. Par exemple, les fibres MYH7+/MYH2-/MYH1- ont été classées dans le type 1, tandis que les fibres MYH7-/MYH2+/MYH1+ ont été classées dans le type mixte 2A/2X (voir le Tableau supplémentaire 2 pour une description complète). En regroupant toutes les fibres, nous avons observé une distribution remarquablement similaire des types de fibres basés sur MYH aux niveaux de l'ARN (Figure 1E) et des protéines (Figure 1F), tandis que la composition relative des types de fibres basés sur MYH variait d'un individu à l'autre, comme prévu (Figure supplémentaire 2A). La plupart des fibres ont été classées comme étant soit de type 1 pur (34–35 %), soit de type 2A (36–38 %), bien qu'un nombre significatif de fibres mixtes de type 2A/2X ait également été détecté (16–19 %). Une différence notable est que les fibres de type 2X pur n'ont pu être détectées qu'au niveau de l'ARN, et non au niveau protéique, ce qui suggère que l'expression rapide de MYH est au moins partiellement régulée au niveau post-transcriptionnel.
Nous avons validé notre méthode de typage des fibres MYH basée sur la protéomique par la technique de dot blot utilisant des anticorps. Les deux méthodes ont permis d'identifier avec une concordance de 100 % les fibres de type 1 et de type 2A pures (voir figure supplémentaire 2B). Cependant, l'approche protéomique s'est avérée plus sensible et plus efficace pour identifier les fibres mixtes et quantifier la proportion de chaque gène MYH dans chaque fibre. Ces résultats démontrent l'efficacité d'une approche omique objective et très sensible pour caractériser les types de fibres musculaires squelettiques.
Nous avons ensuite utilisé les informations combinées fournies par la transcriptomique et la protéomique pour classer objectivement les myofibres en fonction de leur transcriptome ou protéome complet. Grâce à la méthode UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) permettant de réduire la dimensionnalité à six composantes principales (Figures supplémentaires 3A et 3B), nous avons pu visualiser la variabilité des myofibres dans le transcriptome (Figure 1G) et le protéome (Figure 1H). Notamment, les myofibres n'étaient pas regroupées par participant (Figures supplémentaires 3C et 3D) ni par jour de test (Figure supplémentaire 3E) dans les jeux de données transcriptomiques et protéomiques, ce qui suggère que la variabilité intra-individuelle des fibres musculaires squelettiques est supérieure à la variabilité interindividuelle. Sur le graphique UMAP, deux groupes distincts représentant les myofibres « rapides » et « lentes » sont apparus (Figures 1G et 1H). Les myofibres MYH7+ (lentes) étaient regroupées au pôle positif de l'UMAP1, tandis que les myofibres MYH2+ et MYH1+ (rapides) étaient regroupées au pôle négatif de l'UMAP1 (Figures 1I–J). Cependant, aucune distinction n'a été faite entre les types de fibres à contraction rapide (c.-à-d. de type 2A, de type 2X ou mixtes 2A/2X) sur la base de l'expression de MYH, ce qui suggère que l'expression de MYH1 (Figure 1I–J) ou d'autres marqueurs classiques des myofibres 2X tels que ACTN3 ou MYLK2 (Figures supplémentaires 4A–B) ne permet pas de différencier les différents types de myofibres lorsque l'on considère l'ensemble du transcriptome ou du protéome. De plus, comparativement à MYH2 et MYH7, peu de transcrits ou de protéines étaient positivement corrélés à MYH1 (Figures supplémentaires 4C–H), ce qui suggère que l'abondance de MYH1 ne reflète pas pleinement le transcriptome/protéome des myofibres. Des conclusions similaires ont été obtenues lors de l'évaluation de l'expression mixte des trois isoformes de MYH au niveau UMAP (Figures supplémentaires 4I–J). Ainsi, bien que les fibres 2X puissent être identifiées au niveau de la transcription sur la seule base de la quantification de MYH, les fibres MYH1+ ne se distinguent pas des autres fibres rapides lorsqu'on considère l'ensemble du transcriptome ou du protéome.
Dans le cadre d'une première exploration de l'hétérogénéité des fibres lentes au-delà de MYH, nous avons évalué quatre protéines spécifiques de types de fibres lentes : TPM3, TNNT1, MYL3 et ATP2A22. Les sous-types de fibres lentes ont montré des corrélations de Pearson élevées, bien que non parfaites, avec MYH7, tant en transcriptomique (Figure supplémentaire 5A) qu'en protéomique (Figure supplémentaire 5B). Environ 25 % et 33 % des fibres lentes n'ont pas été classées comme fibres lentes pures par l'ensemble des sous-types de gènes/protéines en transcriptomique (Figure supplémentaire 5C) et en protéomique (Figure supplémentaire 5D), respectivement. Par conséquent, la classification des fibres lentes basée sur plusieurs sous-types de gènes/protéines introduit une complexité supplémentaire, même pour les protéines connues pour être spécifiques d'un type de fibre. Ceci suggère que la classification des fibres basée sur les isoformes d'une seule famille de gènes/protéines pourrait ne pas refléter adéquatement la véritable hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques.
Afin d'explorer plus en détail la variabilité phénotypique des fibres musculaires squelettiques humaines à l'échelle du modèle omique complet, nous avons effectué une réduction de dimensionnalité non biaisée des données par analyse en composantes principales (ACP) (Figure 2A). À l'instar des graphiques UMAP, ni le participant ni le jour de test n'ont influencé le regroupement des fibres au niveau de l'ACP (Figures supplémentaires 6A–C). Dans les deux jeux de données, le type de fibre basé sur MYH était expliqué par la PC2, qui montrait un groupe de fibres de type 1 à contraction lente et un second groupe contenant des fibres de type 2A, 2X et mixtes 2A/2X à contraction rapide (Figure 2A). Dans les deux jeux de données, ces deux groupes étaient reliés par un petit nombre de fibres mixtes 1/2A. Comme prévu, l'analyse de surreprésentation des principaux facteurs de la PC a confirmé que la PC2 était déterminée par des signatures contractiles et métaboliques (Figure 2B et Figures supplémentaires 6D–E, Jeux de données supplémentaires 5–6). Dans l'ensemble, le type de fibre basé sur MYH s'est avéré suffisant pour expliquer la variation continue le long de PC2, à l'exception des fibres dites 2X qui étaient distribuées dans tout le transcriptome au sein du cluster rapide.
A. Graphiques d'analyse en composantes principales (ACP) des jeux de données transcriptomiques et protéomiques, colorés selon le type de fibre d'après MYH. B. Analyse d'enrichissement des gènes moteurs (transcrits et protéines) dans les composantes principales 1 et 2 (PC2 et PC1). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du package clusterProfiler et les valeurs p ont été ajustées selon la méthode de Benjamini-Hochberg. C, D. Graphiques d'ACP colorés selon les termes de l'ontologie génique (GO) d'adhérence intercellulaire dans le transcriptome et les termes GO des costamères dans le protéome. Les flèches représentent les gènes moteurs (transcrits et protéines) et leur direction. E, F. Graphiques UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) des caractéristiques cliniquement pertinentes, montrant des gradients d'expression indépendants du type de fibre (lente/rapide). G, H. Corrélations entre les gènes moteurs des composantes principales 2 et 1 (PC2 et PC1) dans les transcriptomes et les protéomes.
De façon inattendue, le type de myofibre basé sur MYH n'expliquait que le deuxième degré de variabilité le plus élevé (PC2), suggérant que d'autres facteurs biologiques non liés à ce type (PC1) jouent un rôle important dans la régulation de l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques. L'analyse de surreprésentation des principaux facteurs de PC1 a révélé que la variabilité de PC1 était principalement déterminée par l'adhérence cellulaire et la teneur en ribosomes dans le transcriptome, ainsi que par les costamères et les protéines ribosomiques dans le protéome (Figure 2B et Figures supplémentaires 6D-E, Données supplémentaires 7). Dans le muscle squelettique, les costamères relient le disque Z au sarcolemme et sont impliqués dans la transmission de la force et la signalisation. Les graphiques ACP annotés, utilisant les caractéristiques d'adhérence cellulaire (transcriptome, Figure 2C) et de costamères (protéome, Figure 2D), ont révélé un fort décalage vers la gauche de PC1, indiquant que ces caractéristiques sont enrichies dans certaines fibres.
Une analyse plus détaillée du regroupement des myofibres au niveau UMAP a révélé que la plupart des caractéristiques présentaient un gradient d'expression basé sur MYH, indépendant du type de myofibre, plutôt que spécifique à un sous-groupe de myofibres. Cette continuité a été observée pour plusieurs gènes associés à des pathologies (Figure 2E), tels que CHCHD10 (maladie neuromusculaire), SLIT3 (atrophie musculaire) et CTDNEP1 (myopathie). Cette continuité a également été observée à l'échelle du protéome, notamment pour des protéines associées aux troubles neurologiques (UGDH), à la signalisation de l'insuline (PHIP) et à la transcription (HIST1H2AB) (Figure 2F). L'ensemble de ces données indique une continuité de l'hétérogénéité des contractions lentes/rapides, indépendante du type de fibre, entre différentes myofibres.
Il est intéressant de noter que les gènes moteurs de PC2 présentaient une bonne corrélation transcriptome-protéome (r = 0,663) (Figure 2G), suggérant que les types de fibres à contraction lente et rapide, et en particulier les propriétés contractiles et métaboliques des fibres musculaires squelettiques, sont régulés au niveau transcriptionnel. En revanche, les gènes moteurs de PC1 ne présentaient aucune corrélation transcriptome-protéome (r = -0,027) (Figure 2H), suggérant que les variations non liées aux types de fibres à contraction lente/rapide sont principalement régulées au niveau post-transcriptionnel. Étant donné que les variations de PC1 étaient principalement expliquées par les termes de l'ontologie des gènes ribosomiques, et considérant le rôle crucial et spécialisé des ribosomes dans la cellule, notamment leur participation active à la traduction des protéines et leur influence³¹, nous avons ensuite entrepris d'étudier cette hétérogénéité ribosomique inattendue.
Nous avons d'abord coloré le graphique d'analyse en composantes principales (ACP) du protéome en fonction de l'abondance relative des protéines associées au terme GOCC « ribosome cytoplasmique » (Figure 3A). Bien que ce terme soit enrichi du côté positif de l'axe PC1, ce qui se traduit par un faible gradient, les protéines ribosomiques induisent une répartition dans les deux sens de PC1 (Figure 3A). Les protéines ribosomiques enrichies du côté négatif de PC1 incluent RPL18, RPS18 et RPS13 (Figure 3B), tandis que RPL31, RPL35 et RPL38 (Figure 3C) sont les principaux facteurs contribuant à l'enrichissement du côté positif de PC1. Il est intéressant de noter que RPL38 et RPS13 sont fortement exprimées dans le muscle squelettique comparativement aux autres tissus (Figure supplémentaire 7A). Ces signatures ribosomiques distinctives sur l'axe PC1 n'ont pas été observées dans le transcriptome (Figure supplémentaire 7B), ce qui indique une régulation post-transcriptionnelle.
A. Analyse en composantes principales (ACP) : représentation colorée selon les termes de l’ontologie génique (GO) des ribosomes cytoplasmiques dans le protéome. Les flèches indiquent le sens de la variation protéique sur le graphique ACP. La longueur des lignes correspond au score de la composante principale pour une protéine donnée. B, C. Représentations graphiques des caractéristiques ACP pour RPS13 et RPL38. D. Analyse de regroupement hiérarchique non supervisée des protéines ribosomiques cytoplasmiques. E. Modèle structural du ribosome 80S (PDB : 4V6X) mettant en évidence les protéines ribosomiques présentant différentes abondances dans les fibres musculaires squelettiques. F. Protéines ribosomiques de stœchiométrie différente localisées près du canal de sortie de l’ARNm.
Les concepts d'hétérogénéité et de spécialisation ribosomiques ont été précédemment proposés. La présence de sous-populations ribosomiques distinctes (hétérogénéité ribosomique) peut influencer directement la traduction des protéines dans différents tissus³² et cellules³³ via la traduction sélective de pools spécifiques d'ARNm³⁴ (spécialisation ribosomique). Afin d'identifier les sous-populations de protéines ribosomiques co-exprimées dans les fibres musculaires squelettiques, nous avons réalisé une analyse de regroupement hiérarchique non supervisée des protéines ribosomiques du protéome (Figure 3D, Données supplémentaires 8). Conformément à nos attentes, les protéines ribosomiques ne se regroupent pas par type de fibre selon MYH. Cependant, nous avons identifié trois groupes distincts de protéines ribosomiques : le premier (ribosomal_cluster_1) est corégulé avec RPL38 et présente donc une expression accrue dans les fibres avec un profil PC1 positif ; le second (ribosomal_cluster_2) est corégulé avec RPS13 et est élevé dans les fibres avec un profil PC1 négatif. Le troisième groupe (ribosomal_cluster_3) ne présente pas d'expression différentielle coordonnée dans les fibres musculaires squelettiques et peut être considéré comme le groupe de protéines ribosomiques « central » du muscle squelettique. Les groupes ribosomiques 1 et 2 contiennent tous deux des protéines ribosomiques connues pour réguler la traduction alternative (par exemple, RPL10A, RPL38, RPS19 et RPS25) et influencer fonctionnellement le développement (par exemple, RPL10A et RPL38).^{34,35,36,37,38} Conformément aux résultats de l'ACP, la représentation hétérogène observée de ces protéines ribosomiques dans les différentes fibres présente également une continuité (Figure supplémentaire 7C).
Pour visualiser la localisation des protéines ribosomiques hétérogènes au sein du ribosome, nous avons utilisé un modèle structural du ribosome 80S humain (Protein Data Bank : 4V6X) (Figure 3E). Après isolement des protéines ribosomiques appartenant à différents clusters ribosomiques, leurs localisations n'étaient pas parfaitement alignées, suggérant que notre approche n'a pas permis d'enrichir certaines régions/fractions du ribosome. Il est intéressant de noter, cependant, que la proportion de protéines de la grande sous-unité dans le cluster 2 était inférieure à celle des clusters 1 et 3 (Figure supplémentaire 7D). Nous avons observé que les protéines présentant une stœchiométrie altérée dans les fibres musculaires squelettiques étaient principalement localisées à la surface du ribosome (Figure 3E), ce qui concorde avec leur capacité à interagir avec les éléments IRES (Internal Ribosome Entry Site) dans différentes populations d'ARNm, coordonnant ainsi une traduction sélective. 40, 41 De plus, de nombreuses protéines présentant une stœchiométrie altérée dans les fibres musculaires squelettiques étaient localisées à proximité de régions fonctionnelles telles que le tunnel de sortie de l'ARNm (Figure 3F), qui régulent sélectivement l'élongation et l'arrêt de la traduction de peptides spécifiques. 42 En résumé, nos données suggèrent que la stœchiométrie des protéines ribosomiques du muscle squelettique présente une hétérogénéité, entraînant des différences entre les fibres musculaires squelettiques.
Nous avons ensuite entrepris d'identifier les signatures des fibres musculaires à contraction rapide et lente et d'explorer les mécanismes de leur régulation transcriptionnelle. En comparant les groupes de fibres à contraction rapide et lente définis par UMAP dans les deux jeux de données (figures 1G–H et 4A–B), les analyses transcriptomiques et protéomiques ont identifié respectivement 1 366 et 804 caractéristiques différentiellement abondantes (figures 4A–B, jeux de données supplémentaires 9–12). Nous avons observé les différences attendues dans les signatures liées aux sarcomères (par exemple, la tropomyosine et la troponine), au couplage excitation-contraction (isoformes de SERCA) et au métabolisme énergétique (par exemple, ALDOA et CKB). De plus, les transcrits et les protéines régulant l'ubiquitination des protéines étaient exprimés différemment dans les fibres à contraction rapide et lente (par exemple, USP54, SH3RF2, USP28 et USP48) (figures 4A–B). De plus, le gène de la protéine microbienne RP11-451G4.2 (DWORF), dont l'expression différentielle a été précédemment démontrée selon les types de fibres musculaires d'agneau⁴³ et qui stimule l'activité de la SERCA dans le muscle cardiaque⁴⁴, était significativement surexprimé dans les fibres musculaires squelettiques lentes (Figure 4A). De même, au niveau de chaque fibre, des différences significatives ont été observées pour des signatures connues, telles que les isoformes de la lactate déshydrogénase impliquées dans le métabolisme (LDHA et LDHB, Figure 4C et Figure supplémentaire 8A)^45,46, ainsi que pour des signatures spécifiques à certains types de fibres, jusqu'alors inconnues (telles que IRX3, USP54, USP28 et DPYSL3) (Figure 4C). Un chevauchement significatif des caractéristiques différentiellement exprimées a été observé entre les jeux de données transcriptomiques et protéomiques (Figure supplémentaire 8B), ainsi qu'une corrélation des variations d'expression, principalement due à l'expression différentielle plus marquée des caractéristiques des sarcomères (Figure supplémentaire 8C). Notamment, certaines signatures (par exemple USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ont montré une forte régulation post-transcriptionnelle uniquement au niveau protéomique et présentaient des profils d'expression spécifiques au type de fibre à contraction lente/rapide (Figure supplémentaire 8C).
Les graphiques A et B (diagrammes de type « volcan ») comparent les clusters lents et rapides identifiés par les graphiques UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) des figures 1G à 1H. Les points colorés représentent les transcrits ou protéines présentant une différence significative (FDR < 0,05), et les points plus foncés représentent les transcrits ou protéines présentant une différence significative (log change > 1). Une analyse statistique bidirectionnelle a été réalisée à l'aide du test de Wald DESeq2 avec ajustement des valeurs p par la méthode de Benjamini-Hochberg (transcriptomique) ou de la méthode du modèle linéaire Limma avec analyse bayésienne empirique suivie d'un ajustement de Benjamini-Hochberg pour les comparaisons multiples (protéomique). C : Graphiques de signature des gènes ou protéines différentiellement exprimés sélectionnés entre les fibres lentes et rapides. D : Analyse d'enrichissement des transcrits et protéines différentiellement exprimés de manière significative. Les valeurs communes sont enrichies dans les deux jeux de données, les valeurs du transcriptome sont enrichies uniquement dans le transcriptome, et les valeurs du protéome sont enrichies uniquement dans le protéome. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du package clusterProfiler avec des valeurs p ajustées selon Benjamini-Hochberg. E. Facteurs de transcription spécifiques au type de fibre identifiés par SCENIC sur la base des scores de spécificité des régulateurs dérivés de SCENIC et de l'expression différentielle des ARNm entre les types de fibres. F. Profilage de facteurs de transcription sélectionnés exprimés différemment entre les fibres lentes et rapides.
Nous avons ensuite réalisé une analyse de surreprésentation des gènes et protéines différentiellement exprimés (Figure 4D, Données supplémentaires 13). L'enrichissement des voies métaboliques pour les caractéristiques différant entre les deux jeux de données a révélé des différences attendues, telles que la β-oxydation des acides gras et le métabolisme des corps cétoniques (fibres lentes), la contraction des myofilaments/muscles (fibres rapides et lentes, respectivement) et le catabolisme des glucides (fibres rapides). L'activité de la phosphatase sérine/thréonine était également élevée dans les fibres rapides, sous l'effet de caractéristiques telles que les sous-unités régulatrices et catalytiques de la phosphatase (PPP3CB, PPP1R3D et PPP1R3A), connues pour réguler le métabolisme du glycogène (47) (Figures supplémentaires 8D et 8E). D'autres voies métaboliques enrichies dans les fibres rapides incluaient les corps P (YTHDF3, TRIM21, LSM2) dans le protéome (Fig. S8F), potentiellement impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle (48), et l'activité des facteurs de transcription (SREBF1, RXRG, RORA) dans le transcriptome (Fig. S8G). Les fibres lentes étaient enrichies en activité oxydoréductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Fig. S8H), en liaison aux amides (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Fig. S8I), en matrice extracellulaire (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Fig. S8J) et en activité récepteur-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Fig. S8K).
Afin d'approfondir notre compréhension de la régulation transcriptionnelle sous-jacente aux caractéristiques des fibres musculaires lentes et rapides, nous avons réalisé une analyse d'enrichissement des facteurs de transcription à l'aide de SCENIC49 (Données supplémentaires 14). De nombreux facteurs de transcription étaient significativement enrichis entre les fibres musculaires rapides et lentes (Figure 4E). Parmi eux figuraient des facteurs de transcription tels que MAFA, précédemment associé au développement des fibres musculaires rapides⁵⁰, ainsi que plusieurs facteurs de transcription non encore associés aux programmes géniques spécifiques aux types de fibres musculaires. PITX1, EGR1 et MYF6 étaient les facteurs de transcription les plus enrichis dans les fibres musculaires rapides (Figure 4E). À l'inverse, ZSCAN30 et EPAS1 (également connu sous le nom de HIF2A) étaient les facteurs de transcription les plus enrichis dans les fibres musculaires lentes (Figure 4E). Conformément à ces observations, MAFA était exprimé à des niveaux plus élevés dans la région UMAP correspondant aux fibres musculaires rapides, tandis qu'EPAS1 présentait le profil d'expression inverse (Figure 4F).
Outre les gènes codant pour des protéines, de nombreux biotypes d'ARN non codants pourraient être impliqués dans la régulation du développement humain et des maladies.^{51, 52} Dans les jeux de données transcriptomiques, plusieurs ARN non codants présentent une spécificité de type de fibre (Figure 5A et Données supplémentaires 15), notamment LINC01405, hautement spécifique des fibres lentes et dont l'expression est diminuée dans les muscles de patients atteints de myopathie mitochondriale.⁵³ À l'inverse, RP11-255P5.3, correspondant au gène lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)⁵⁴, présente une spécificité de type fibre rapide. Les deux lignées cellulaires LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) et RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) présentent une spécificité pour le muscle squelettique (Figures supplémentaires 9A et 9B) et ne possèdent aucun gène contractile connu dans leur région génomique de 1 Mb, ce qui suggère qu'elles jouent un rôle spécialisé dans la régulation des types de fibres plutôt que dans la régulation des gènes contractiles voisins. Les profils d'expression spécifiques aux types de fibres lentes et rapides de LINC01405 et RP11-255P5.3, respectivement, ont été confirmés par RNAscope (Figures 5B et 5C).
A. L'expression des ARN non codants est significativement régulée dans les fibres musculaires à contraction lente et rapide. B. Images RNAscope représentatives illustrant la spécificité de type fibre lente et rapide des ARN non codants LINC01405 et RP11-255P5.3, respectivement. Échelle : 50 µm. C. Quantification de l'expression des ARN non codants spécifiques au type de myofibre, déterminée par RNAscope (n = 3 biopsies provenant d'individus indépendants, comparant les fibres musculaires rapides et lentes chez chaque individu). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'un test t de Student bilatéral. Les diagrammes en boîte représentent la médiane et les premier et troisième quartiles, les moustaches indiquant les valeurs minimale et maximale. D. Flux de travail d'identification de novo des protéines microbiennes (créé avec BioRender.com). E. La protéine microbienne LINC01405_ORF408:17441:17358 est spécifiquement exprimée dans les fibres musculaires squelettiques lentes (n = 5 biopsies provenant de participants indépendants, comparant les fibres musculaires rapides et lentes chez chaque participant). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du modèle linéaire de Limm combiné à une approche bayésienne empirique, suivie de la méthode de Benjamini-Hochberg pour les comparaisons multiples avec ajustement de la valeur p. Les diagrammes en boîte représentent la médiane, le premier et le troisième quartile, les moustaches indiquant les valeurs maximales et minimales.
Des études récentes ont montré que de nombreux transcrits non codants putatifs codent des protéines microbiennes transcrites, dont certaines régulent la fonction musculaire.^{44, 55} Afin d'identifier les protéines microbiennes présentant une spécificité potentielle pour un type de fibre musculaire, nous avons analysé notre jeu de données protéomiques de 1 000 fibres à l'aide d'un fichier FASTA personnalisé contenant les séquences des transcrits non codants (n = 305) présents dans ce jeu de données (Figure 5D). Nous avons identifié 197 protéines microbiennes issues de 22 transcrits différents, dont 71 étaient régulées différemment entre les fibres musculaires squelettiques lentes et rapides (Figure supplémentaire 9C et Données supplémentaires 16). Pour LINC01405, trois produits protéiques microbiens ont été identifiés, dont l'un présentait une spécificité pour les fibres lentes similaire à celle de son transcrit (Figure 5E et Figure supplémentaire 9D). Ainsi, nous avons identifié LINC01405 comme un gène codant une protéine microbienne spécifique des fibres musculaires squelettiques lentes.
Nous avons mis au point un protocole complet pour la caractérisation protéomique à grande échelle des fibres musculaires individuelles et identifié les régulateurs de l'hétérogénéité des fibres à l'état sain. Nous avons appliqué ce protocole afin de comprendre comment les myopathies à bâtonnets affectent l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques. Les myopathies à bâtonnets sont des maladies musculaires héréditaires qui provoquent une faiblesse musculaire et, chez les enfants atteints, s'accompagnent de diverses complications, notamment une détresse respiratoire, une scoliose et une mobilité réduite des membres.^19,20 Typiquement, dans les myopathies à bâtonnets, les variants pathogènes de gènes tels que l'actine alpha 1 (ACTA1) entraînent une prédominance des fibres lentes, bien que cet effet soit hétérogène. Une exception notable est la myopathie à bâtonnets associée à la troponine T1 (TNNT1), qui présente une prédominance des fibres rapides. Ainsi, une meilleure compréhension de l'hétérogénéité sous-jacente à la dysrégulation des fibres musculaires squelettiques observée dans les myopathies à bâtonnets pourrait contribuer à élucider la relation complexe entre ces maladies et le type de myofibre.
Comparativement aux témoins sains (n=3 par groupe), les myofibres isolées de patients atteints de myopathie à bâtonnets et porteurs de mutations des gènes ACTA1 et TNNT1 présentaient une atrophie ou une dystrophie myofibrique marquée (Figure 6A, Tableau supplémentaire 3). La quantité limitée de matériel disponible a posé d'importants défis techniques pour l'analyse protéomique. Malgré cela, nous avons pu détecter 2 485 protéines dans 272 myofibres squelettiques. Après sélection d'au moins 1 000 protéines quantifiées par fibre, 250 fibres ont été soumises à une analyse bioinformatique. Après filtrage, une moyenne de 1 573 ± 359 protéines par fibre a été quantifiée (Figure supplémentaire 10A, Données supplémentaires 17-18). Il est à noter que, malgré la réduction significative de la taille des fibres, la profondeur protéomique des échantillons de patients atteints de myopathie à bâtonnets n'était que légèrement réduite. De plus, le traitement de ces données à l'aide de nos propres fichiers FASTA (incluant les transcrits non codants) nous a permis d'identifier cinq protéines microbiennes dans les myofibres squelettiques de patients atteints de myopathie à bâtonnets (Données supplémentaires 19). La gamme dynamique du protéome était significativement plus étendue, et le nombre total de protéines dans le groupe témoin était en bonne corrélation avec les résultats d'une analyse protéomique antérieure portant sur 1 000 fibres (Figures supplémentaires 10B et 10C).
A. Images microscopiques montrant l'atrophie ou la dystrophie des fibres et la prédominance des différents types de fibres selon MYH dans les myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 (NM). Échelle : 100 µm. Afin d'assurer la reproductibilité de la coloration chez les patients atteints de myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1, trois biopsies de patients ont été colorées deux à trois fois (quatre coupes par cas) avant la sélection d'images représentatives. B. Proportions des types de fibres chez les participants selon MYH. C. Analyse en composantes principales (ACP) des fibres musculaires squelettiques chez les patients atteints de myopathies à bâtonnets et les témoins. D. Fibres musculaires squelettiques de patients atteints de myopathies à bâtonnets et de témoins projetées sur un graphique ACP établi à partir des 1 000 fibres analysées dans la figure 2. Par exemple, graphiques en volcan comparant les différences entre les participants atteints de myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 et les témoins, et entre les participants atteints de myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1. Les cercles colorés indiquent les protéines présentant une différence significative (p < 0,05), et les points noirs, celles présentant une différence significative (FDR < 0,05). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du modèle linéaire Limma et de méthodes bayésiennes empiriques, suivies d'un ajustement des valeurs p pour les comparaisons multiples par la méthode de Benjamini-Hochberg. H. Analyse d'enrichissement des protéines présentant une expression différentielle significative dans l'ensemble du protéome et dans les fibres de type 1 et 2A. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du package clusterProfiler et les valeurs p ont été ajustées par la méthode de Benjamini-Hochberg. I, J. Graphiques d'analyse en composantes principales (ACP) colorés selon les termes d'ontologie génique (GO) de la matrice extracellulaire et des mitochondries.
Les myopathies à bâtonnets pouvant influencer la proportion des différents types de myofibres exprimant MYH dans le muscle squelettique^19,20, nous avons d'abord examiné ces types chez des patients atteints de myopathies à bâtonnets et chez des sujets témoins. Nous avons déterminé le type de myofibre par une méthode non biaisée, précédemment décrite pour le test sur 1 000 myofibres (Figures supplémentaires 10D et 10E), et n'avons de nouveau pas réussi à identifier de myofibres 2X pures (Figure 6B). Nous avons observé un effet hétérogène des myopathies à bâtonnets sur le type de myofibre : deux patients porteurs de mutations du gène ACTA1 présentaient une proportion accrue de myofibres de type 1, tandis que deux patients atteints de myopathie à bâtonnets liée au gène TNNT1 présentaient une proportion diminuée de ces myofibres (Figure 6B). En effet, l'expression de MYH2 et des isoformes rapides de la troponine (TNNC2, TNNI2 et TNNT3) était diminuée dans les myopathies à bâtonnets ACTA1, tandis que l'expression de MYH7 était diminuée dans les myopathies à bâtonnets TNNT1 (Figure supplémentaire 11A). Ceci concorde avec les observations antérieures d'une hétérogénéité des types de myofibres dans les myopathies à bâtonnets.^19,20 Nous avons confirmé ces résultats par immunohistochimie et constaté que les patients atteints de myopathie à bâtonnets ACTA1 présentaient une prédominance de myofibres de type 1, alors que les patients atteints de myopathie à bâtonnets TNNT1 présentaient le profil inverse (Figure 6A).
Au niveau du protéome de la fibre unique, les fibres musculaires squelettiques des patients atteints de myopathie à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 se regroupaient avec la majorité des fibres témoins, les fibres de la myopathie à bâtonnets TNNT1 étant généralement les plus sévèrement affectées (Figure 6C). Ceci était particulièrement évident sur les graphiques d'analyse en composantes principales (ACP) des fibres pseudo-gonflées pour chaque patient, les patients 2 et 3 atteints de myopathie à bâtonnets TNNT1 apparaissant les plus éloignés des échantillons témoins (Figure supplémentaire 11B, Jeu de données supplémentaire 20). Afin de mieux comprendre comment les fibres des patients atteints de myopathie se comparent aux fibres saines, nous avons utilisé des informations détaillées obtenues par l'analyse protéomique de 1 000 fibres provenant de participants adultes sains. Nous avons projeté les fibres de l'ensemble de données sur la myopathie (patients atteints de myopathie à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 et témoins) sur le graphique ACP obtenu à partir de l'analyse protéomique des 1 000 fibres (Figure 6D). La distribution des types de fibres MYH le long de l'axe PC2 dans les fibres témoins était similaire à celle obtenue par l'analyse protéomique de 1 000 fibres. Cependant, chez les patients atteints de myopathie à bâtonnets, la plupart des fibres se situaient plus bas sur l'axe PC2, se superposant aux fibres musculaires rapides saines, indépendamment de leur type de fibre MYH natif. Ainsi, bien que les patients atteints de myopathie à bâtonnets ACTA1 présentent une prédominance des fibres de type 1 lors de la quantification par des méthodes basées sur MYH, les myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 induisent toutes deux une prédominance des fibres rapides dans le protéome des fibres musculaires squelettiques.
Nous avons ensuite comparé directement chaque groupe de patients à des témoins sains et identifié 256 et 552 protéines différentiellement exprimées dans les myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1, respectivement (Figure 6E–G et Figure supplémentaire 11C, Données supplémentaires 21). L’analyse d’enrichissement génique a révélé une diminution coordonnée des protéines mitochondriales (Figure 6H–I, Données supplémentaires 22). De façon surprenante, malgré la prédominance différentielle des types de fibres dans les myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1, cette diminution était totalement indépendante du type de fibre basé sur MYH (Figure 6H et Figures supplémentaires 11D–I, Données supplémentaires 23). Trois protéines microbiennes étaient également régulées dans les myopathies à bâtonnets ACTA1 ou TNNT1. Deux de ces microprotéines, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (également connue sous le nom de LINC00598 ou Lnc-FOXO1) et ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), ont présenté une abondance différentielle uniquement dans les myofibres de type 1. Il a été précédemment rapporté que ENSG00000215483_TR14_ORF67 joue un rôle dans la régulation du cycle cellulaire.⁵⁶ En revanche, l'expression d'ENSG00000232046_TR1_ORF437 (correspondant à LINC01798) était augmentée dans les myofibres de type 1 et de type 2A chez les patients atteints de myopathie à la némaline ACTA1, comparativement aux témoins sains (Figure supplémentaire 12A, Données supplémentaires 24). En revanche, les protéines ribosomales n’ont pas été affectées en grande partie par la myopathie à némaline, bien que RPS17 ait été sous-régulé dans la myopathie à némaline ACTA1 (Fig. 6E).
L'analyse d'enrichissement a également révélé une surexpression des processus du système immunitaire dans les myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1, tandis que l'adhérence cellulaire était également accrue dans la myopathie à bâtonnets TNNT1 (Figure 6H). L'enrichissement de ces facteurs extracellulaires s'est traduit par un déplacement des protéines de la matrice extracellulaire (PCA) dans les composantes principales 1 et 2 (PC1 et PC2) vers les fibres les plus affectées (Figure 6J). Les deux groupes de patients présentaient une expression accrue de protéines extracellulaires impliquées dans les réponses immunitaires et les mécanismes de réparation du sarcolemme, telles que les annexines (ANXA1, ANXA2, ANXA5)^57,58 et leur protéine d'interaction S100A1⁵⁹ (Figures supplémentaires 12B et 12C). Ce processus a déjà été décrit comme étant amplifié dans les dystrophies musculaires⁶⁰, mais, à notre connaissance, n'avait pas encore été associé aux myopathies à bâtonnets. Le fonctionnement normal de cette machinerie moléculaire est nécessaire à la réparation du sarcolemme après une lésion et à la fusion des myocytes nouvellement formés avec les myofibres58,61. Ainsi, l'activité accrue de ce processus dans les deux groupes de patients suggère une réponse réparatrice à une lésion causée par l'instabilité des myofibres.
Les effets de chaque myopathie à bâtonnets étaient fortement corrélés (r = 0,736) et présentaient un chevauchement significatif (Figures supplémentaires 11A et 11B), indiquant que les myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 ont des effets similaires sur le protéome. Cependant, certaines protéines étaient régulées uniquement dans la myopathie à bâtonnets ACTA1 ou TNNT1 (Figures supplémentaires 11A et 11C). La protéine profibrotique MFAP4 était l'une des protéines les plus surexprimées dans la myopathie à bâtonnets TNNT1, mais restait inchangée dans la myopathie à bâtonnets ACTA1. SKIC8, un composant du complexe PAF1C responsable de la régulation de la transcription des gènes HOX, était sous-exprimé dans la myopathie à bâtonnets TNNT1, mais non affecté dans la myopathie à bâtonnets ACTA1 (Figure supplémentaire 11A). La comparaison directe des myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 a révélé une réduction plus importante des protéines mitochondriales et une augmentation des protéines du système immunitaire dans la myopathie à bâtonnets TNNT1 (figures 6G à 6H et figures supplémentaires 11C et 11H à 11I). Ces données concordent avec l'atrophie/dystrophie plus marquée observée dans la myopathie à bâtonnets TNNT1 par rapport à la myopathie à bâtonnets TNNT1 (figure 6A), suggérant que la myopathie à bâtonnets TNNT1 représente une forme plus sévère de la maladie.
Afin d'évaluer si les effets observés de la myopathie à bâtonnets persistent au niveau du muscle entier, nous avons réalisé une analyse protéomique globale de biopsies musculaires provenant d'une même cohorte de patients atteints de myopathie à bâtonnets TNNT1 et les avons comparées à celles de témoins (n=3 par groupe) (Figure supplémentaire 13A, Données supplémentaires 25). Conformément à nos attentes, les témoins étaient étroitement apparentés lors de l'analyse en composantes principales, tandis que les patients atteints de myopathie à bâtonnets TNNT1 présentaient une variabilité inter-échantillons plus élevée, similaire à celle observée lors de l'analyse de fibres individuelles (Figure supplémentaire 13B). L'analyse globale a reproduit les protéines différentiellement exprimées (Figure supplémentaire 13C, Données supplémentaires 26) et les processus biologiques (Figure supplémentaire 13D, Données supplémentaires 27) mis en évidence par la comparaison de fibres individuelles, mais n'a pas permis de distinguer les différents types de fibres ni de rendre compte de l'hétérogénéité des effets de la maladie selon les fibres.
L’ensemble de ces données démontre que la protéomique de la myofibre unique peut élucider des caractéristiques biologiques cliniques indétectables par des méthodes ciblées telles que l’immunoblot. De plus, ces données soulignent les limites de l’utilisation du seul typage des fibres d’actine (MYH) pour décrire l’adaptation phénotypique. En effet, bien que le changement de type de fibre diffère entre les myopathies à bâtonnets d’actine et de troponine, ces deux myopathies à bâtonnets découplent le typage des fibres MYH du métabolisme des fibres musculaires squelettiques, conduisant à un protéome musculaire plus rapide et moins oxydatif.
L'hétérogénéité cellulaire est essentielle à la capacité des tissus à répondre à leurs diverses exigences. Dans le muscle squelettique, elle est souvent décrite comme la présence de types de fibres caractérisés par différents degrés de force et de fatigabilité. Cependant, il est clair que cela n'explique qu'une faible part de la variabilité des fibres musculaires squelettiques, qui est bien plus variable, complexe et multifactorielle qu'on ne le pensait. Les progrès technologiques ont permis de mieux comprendre les facteurs régulant les fibres musculaires squelettiques. En effet, nos données suggèrent que les fibres de type 2X ne constituent pas un sous-type distinct de fibres musculaires squelettiques. De plus, nous avons identifié des protéines métaboliques, des protéines ribosomiques et des protéines associées aux cellules comme des déterminants majeurs de l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques. En appliquant notre méthode protéomique à des échantillons de patients atteints de myopathie à nématodes, nous avons démontré que le typage des fibres basé sur le gène MYH ne reflète pas pleinement l'hétérogénéité du muscle squelettique, en particulier lorsque le système est perturbé. En effet, quel que soit le type de fibre à base de MYH, la myopathie à nématodes entraîne une évolution vers des fibres plus rapides et moins oxydatives.
La classification des fibres musculaires squelettiques remonte au XIXe siècle. Les analyses omiques récentes nous ont permis de commencer à comprendre les profils d'expression des différents types de fibres MYH et leurs réponses à divers stimuli. Comme décrit ici, les approches omiques présentent également l'avantage d'une plus grande sensibilité pour la quantification des marqueurs de type de fibre que les méthodes traditionnelles basées sur les anticorps, sans nécessiter la quantification d'un seul (ou de quelques) marqueurs pour définir un type de fibre musculaire squelettique. Nous avons utilisé des approches transcriptomiques et protéomiques complémentaires et intégré les résultats afin d'examiner la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle de l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques humaines. Cette approche n'a pas permis d'identifier de fibres de type 2X pures au niveau protéique dans le vaste latéral de notre cohorte de jeunes hommes sains. Ce résultat est cohérent avec les études antérieures sur fibres uniques qui ont trouvé moins de 1 % de fibres de type 2X pures dans le vaste latéral sain, bien que cela doive être confirmé dans d'autres muscles à l'avenir. La divergence entre la détection de fibres 2X quasi pures au niveau de l'ARNm et celle de fibres mixtes 2A/2X uniquement au niveau protéique est surprenante. L'expression de l'ARNm des isoformes de MYH n'est pas circadienne⁶⁷, ce qui suggère qu'il est peu probable que nous ayons manqué le signal d'apparition de MYH2 dans des fibres 2X apparemment pures au niveau de l'ARNm. Une explication possible, bien que purement hypothétique, pourrait résider dans des différences de stabilité des protéines et/ou de l'ARNm entre les isoformes de MYH. En effet, aucune fibre rapide n'est pure à 100 % pour aucune isoforme de MYH, et il est difficile de déterminer si des niveaux d'expression de l'ARNm de MYH1 compris entre 70 et 90 % se traduiraient par une abondance égale de MYH1 et MYH2 au niveau protéique. Cependant, en considérant le transcriptome ou le protéome entier, l'analyse de regroupement permet d'identifier avec certitude deux groupes distincts représentant les fibres musculaires squelettiques lentes et rapides, indépendamment de leur composition précise en MYH. Ceci est cohérent avec les analyses utilisant des approches transcriptomiques mononucléaires, qui n'identifient généralement que deux groupes myonucléaires distincts.^{68, 69, 70} De plus, bien que des études protéomiques antérieures aient identifié des fibres de type 2X, ces fibres ne forment pas de groupe distinct des autres fibres rapides et ne présentent qu'un petit nombre de protéines différentiellement abondantes par rapport aux autres types de fibres, selon le gène MYH.¹⁴ Ces résultats suggèrent qu'il convient de revenir à la classification des fibres musculaires du début du XX^e siècle, qui divisait les fibres musculaires squelettiques humaines non pas en trois classes distinctes selon le gène MYH, mais en deux groupes selon leurs propriétés métaboliques et contractiles.⁶³
Plus important encore, l'hétérogénéité des myofibres doit être considérée selon de multiples dimensions. Des études « omiques » antérieures ont orienté cette réflexion, suggérant que les fibres musculaires squelettiques ne forment pas d'amas distincts mais sont organisées de manière continue.^{11, 13, 14, 64, 71} Nous montrons ici que, outre les différences de propriétés contractiles et métaboliques des muscles squelettiques, les myofibres peuvent être différenciées par des caractéristiques liées aux interactions intercellulaires et aux mécanismes de traduction. En effet, nous avons observé une hétérogénéité ribosomique dans les fibres musculaires squelettiques, contribuant à une hétérogénéité indépendante des types de fibres lentes et rapides. La cause sous-jacente de cette hétérogénéité myofibrique substantielle, indépendante du type de fibre, demeure incertaine, mais pourrait être liée à une organisation spatiale spécialisée au sein des faisceaux musculaires, répondant de manière optimale à des forces et des charges spécifiques,⁷² à une communication cellulaire ou spécifique à l'organe avec d'autres types cellulaires du microenvironnement musculaire,^{73, 74, 75} ou encore à des différences d'activité ribosomique au sein des myofibres individuelles. En effet, l'hétéroplasmie ribosomique, que ce soit par substitution paralogue de RPL3 et RPL3L ou au niveau de la 2′O-méthylation de l'ARNr, s'est avérée associée à l'hypertrophie du muscle squelettique76,77. Les applications multi-omiques et spatiales combinées à la caractérisation fonctionnelle des myofibres individuelles permettront d'approfondir notre compréhension de la biologie musculaire au niveau multi-omique78.
En analysant les protéomes de myofibres isolées de patients atteints de myopathies à bâtonnets, nous avons démontré l'utilité, l'efficacité et l'applicabilité de la protéomique de myofibres isolées pour élucider la physiopathologie clinique du muscle squelettique. De plus, en comparant notre méthodologie à l'analyse protéomique globale, nous avons pu démontrer que la protéomique de myofibres isolées fournit un niveau d'information équivalent à celui de la protéomique tissulaire globale et l'enrichit en tenant compte de l'hétérogénéité interfibre et du type de myofibre. Outre les différences attendues (bien que variables) du ratio de types de fibres observées dans les myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1 par rapport aux témoins sains¹⁹, nous avons également observé un remodelage oxydatif et extracellulaire indépendant du changement de type de fibre médié par MYH. La fibrose a déjà été décrite dans les myopathies à bâtonnets TNNT1.¹⁹ Cependant, notre analyse complète cette observation en révélant également une augmentation des taux de protéines extracellulaires sécrétées liées au stress, telles que les annexines, impliquées dans les mécanismes de réparation du sarcolemme, dans les myofibres de patients atteints de myopathies à bâtonnets ACTA1 et TNNT1.^57,58,59 En conclusion, l'augmentation des taux d'annexine dans les myofibres de patients atteints de myopathie à bâtonnets pourrait représenter une réponse cellulaire visant à réparer les myofibres sévèrement atrophiées.
Bien que cette étude représente à ce jour la plus vaste analyse omique de fibres musculaires complètes chez l'humain, elle n'est pas sans limites. Nous avons isolé les fibres musculaires squelettiques à partir d'un échantillon relativement restreint et homogène de participants, et d'un seul muscle (le vaste latéral). Il est donc impossible d'exclure l'existence de populations de fibres spécifiques selon les types musculaires et dans des conditions physiologiques musculaires extrêmes. Par exemple, nous ne pouvons exclure la possibilité qu'un sous-ensemble de fibres ultrarapides (par exemple, des fibres 2X pures) apparaisse chez les sprinteurs et/ou les athlètes de force de haut niveau⁷⁹ ou lors de périodes d'inactivité musculaire^66,80. De plus, la taille limitée de l'échantillon de participants ne nous a pas permis d'étudier les différences liées au sexe dans l'hétérogénéité des fibres, car les proportions de types de fibres diffèrent entre les hommes et les femmes. Enfin, nous n'avons pas pu réaliser d'analyses transcriptomiques et protéomiques sur les mêmes fibres musculaires ou sur les mêmes échantillons provenant des mêmes participants. Alors que nous et d'autres continuons d'optimiser les analyses unicellulaires et monomyofibres à l'aide de l'analyse omique pour obtenir une quantité d'échantillons ultra-faible (comme démontré ici dans l'analyse des fibres de patients atteints de myopathie mitochondriale), la possibilité de combiner des approches multi-omiques (et fonctionnelles) au sein de fibres musculaires uniques devient évidente.
Globalement, nos données identifient et expliquent les mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels à l'origine de l'hétérogénéité du muscle squelettique. Plus précisément, nous présentons des données qui remettent en question un dogme établi de longue date en physiologie musculaire, associé à la définition classique des types de fibres basée sur le gène MYH. Nous espérons relancer le débat et, à terme, repenser notre compréhension de la classification et de l'hétérogénéité des fibres musculaires squelettiques.
Quatorze participants caucasiens (12 hommes et 2 femmes) ont accepté volontairement de participer à cette étude. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire de Gand (BC-10237), respecte la Déclaration d’Helsinki de 2013 et a été enregistrée sur ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Les caractéristiques générales des participants sont présentées dans le tableau supplémentaire 1. Après avoir obtenu leur consentement éclairé oral et écrit, les participants ont subi un examen médical avant leur inclusion définitive dans l’étude. Les participants étaient jeunes (22-42 ans), en bonne santé (sans antécédents médicaux ni tabagisme) et modérément actifs physiquement. La consommation maximale d’oxygène a été déterminée à l’aide d’un ergomètre à marche pour évaluer la condition physique, comme décrit précédemment.⁸¹
Des biopsies musculaires ont été réalisées à trois reprises, au repos et à jeun, à 14 jours d'intervalle. Ces prélèvements s'inscrivant dans le cadre d'une étude plus vaste, les participants ont consommé, 40 minutes avant la biopsie, soit un placebo (lactose), soit un antagoniste des récepteurs H1 (540 mg de fexofénadine), soit un antagoniste des récepteurs H2 (40 mg de famotidine). Nous avons précédemment démontré que ces antagonistes des récepteurs de l'histamine n'affectent pas la capacité fonctionnelle des muscles squelettiques au repos⁸¹, et aucune agrégation liée à l'état n'a été observée dans nos graphiques de contrôle qualité (figures supplémentaires 3 et 6). Un régime alimentaire standardisé (41,4 kcal/kg de poids corporel, 5,1 g/kg de glucides, 1,4 g/kg de protéines et 1,6 g/kg de lipides) a été maintenu pendant les 48 heures précédant chaque jour d'expérimentation, et un petit-déjeuner standardisé (1,5 g/kg de glucides) a été consommé le matin du jour de l'expérimentation. Sous anesthésie locale (0,5 ml de lidocaïne à 1 % sans épinéphrine), des biopsies musculaires ont été obtenues à partir du muscle vaste latéral par aspiration percutanée de Bergström.82 Les échantillons musculaires ont été immédiatement inclus dans du RNAlater et conservés à 4 °C jusqu'à la dissection manuelle des fibres (jusqu'à 3 jours).
Les faisceaux de myofibres fraîchement isolés ont été transférés dans un milieu RNAlater frais, dans une boîte de culture. Les myofibres individuelles ont ensuite été disséquées manuellement à l'aide d'un stéréomicroscope et de fines pinces. Vingt-cinq fibres ont été prélevées de chaque biopsie, en veillant particulièrement à sélectionner des fibres provenant de différentes zones de la biopsie. Après dissection, chaque fibre a été délicatement immergée dans 3 μl de tampon de lyse (kit de lyse cellulaire SingleShot, Bio-Rad) contenant des enzymes protéinase K et DNase afin d'éliminer les protéines et l'ADN indésirables. La lyse cellulaire et l'élimination des protéines/ADN ont ensuite été amorcées par une brève agitation au vortex, suivie d'une centrifugation du liquide dans une microcentrifugeuse et d'une incubation à température ambiante (10 min). Le lysat a ensuite été incubé dans un thermocycleur (T100, Bio-Rad) à 37 °C pendant 5 min, puis à 75 °C pendant 5 min, et enfin immédiatement conservé à -80 °C jusqu'à son utilisation ultérieure.
Des banques d'ARN polyadénylés compatibles avec Illumina ont été préparées à partir de 2 µl de lysat de myofibres à l'aide du kit QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep (Lexogen). La méthode détaillée est décrite dans le manuel du fabricant. Le processus débute par la synthèse du premier brin d'ADNc par transcription inverse, au cours de laquelle des identifiants moléculaires uniques (UMI) et des codes-barres i1 spécifiques à chaque échantillon sont introduits afin de garantir le regroupement des échantillons et de réduire la variabilité technique lors des étapes de traitement ultérieures. L'ADNc de 96 myofibres est ensuite regroupé et purifié à l'aide de billes magnétiques. L'ARN est alors éliminé et la synthèse du second brin est réalisée à l'aide d'amorces aléatoires. La banque est purifiée à nouveau à l'aide de billes magnétiques, des étiquettes i5/i7 spécifiques à chaque pool sont ajoutées, puis l'amplification par PCR est effectuée. Une dernière étape de purification permet d'obtenir des banques compatibles avec Illumina. La qualité de chaque pool de banques a été évaluée à l'aide du kit d'analyse d'ADN de petits fragments haute sensibilité (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
D’après la quantification par Qubit, les pools ont été regroupés à des concentrations équimolaires (2 nM). Le pool résultant a ensuite été séquencé sur un instrument NovaSeq 6000 en mode standard à l’aide du kit de réactifs NovaSeq S2 (1 × 100 nucléotides) avec une charge de 2 nM (4 % PhiX).
Notre pipeline est basé sur le pipeline d'analyse de données QuantSeq Pool de Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Les données ont d'abord été démultiplexées avec bcl2fastq2 (v2.20.0) à partir de l'index i7/i5. La lecture 2 a ensuite été démultiplexée avec idemux (v0.1.6) à partir du code-barres de l'échantillon i1 et les séquences UMI ont été extraites avec umi_tools (v1.0.1). Les lectures ont ensuite été élaguées avec cutadapt (v3.4) en plusieurs étapes afin d'éliminer les lectures courtes (< 20 nucléotides) ou celles composées uniquement de séquences adaptatrices. Les lectures ont ensuite été alignées sur le génome humain à l'aide de STAR (v2.6.0c) et les fichiers BAM ont été indexés avec SAMtools (v1.11). Les lectures dupliquées ont été supprimées à l'aide de umi_tools (v1.0.1). Enfin, le comptage des alignements a été effectué à l'aide de featureCounts dans Subread (v2.0.3). Le contrôle qualité a été réalisé à l'aide de FastQC (v0.11.9) à plusieurs étapes intermédiaires du pipeline.
L'ensemble des traitements bioinformatiques et de la visualisation ont été réalisés sous R (v4.2.3), principalement à l'aide du workflow Seurat (v4.4.0). Les valeurs UMI individuelles et les matrices de métadonnées ont ainsi été transformées en objets Seurat. Les gènes exprimés dans moins de 30 % des fibres ont été éliminés. Les échantillons de faible qualité ont été supprimés sur la base d'un seuil minimal de 1 000 valeurs UMI et 1 000 gènes détectés. Au final, 925 fibres ont satisfait à toutes les étapes de contrôle qualité. Les valeurs UMI ont été normalisées à l'aide de la méthode Seurat SCTransform v2, incluant l'ensemble des 7 418 caractéristiques détectées, et les différences interindividuelles ont été corrigées par régression. Toutes les métadonnées pertinentes sont disponibles dans le jeu de données supplémentaire 28.