Effet anti-biofilm et stimulation de la guérison des pansements en nitrate d'argent

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La croissance microbienne des plaies se manifeste souvent comme des biofilms, qui interfèrent avec la guérison et sont difficiles à éradiquer. De nouveaux pansements en argent prétendent lutter contre les infections des plaies, mais leur efficacité antibiofilm et leurs effets de guérison indépendants de l'infection sont généralement inconnus. En utilisant des modèles de biofilm in vitro et in vivo de Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa, nous rapportons l'efficacité des pansements générateurs d'ions Ag1 +; Ag1 + pansements contenant de l'acide éthylènediaminetraacétique et du chlorure de benzethonium (AG1 + / EDTA / BC) et des pansements contenant du nitrate d'argent (Ag oxysalts). , qui produisent des ions Ag1 +, Ag2 + et Ag3 + pour lutter contre le biofilm des plaies et son effet sur la guérison. Les pansements AG1 + ont eu des effets minimaux sur le biofilm des plaies in vitro et chez la souris (C57BL / 6J). En revanche, les sels AG oxygénés et les pansements AG1 + / EDTA / BC ont considérablement réduit le nombre de bactéries viables dans les biofilms in vitro et ont démontré une réduction significative des composants bactériens et EPS dans les biofilms des plaies de souris. Ces pansements ont eu des effets différents sur la guérison des plaies infectées par le biofilm et non infectées par le biofilm, avec des pansements de sel oxygénés ayant des effets plus bénéfiques sur la réépithélialisation, la taille des plaies et l'inflammation par rapport aux traitements témoins et à d'autres pansements d'argent. Les différentes propriétés physicochimiques des pansements en argent peuvent avoir des effets différents sur le biofilm des plaies et la guérison, et cela doit être pris en compte lors de la sélection d'un pansement pour le traitement des plaies infectées par le biofilm.
Les blessures chroniques sont définies comme «des blessures qui ne progressent pas à travers les stades normaux de la guérison d'une manière ordonnée et opportune» 1. Les blessures chroniques créent un fardeau psychologique, social et économique pour les patients et le système de santé. Les dépenses annuelles du NHS pour traiter les blessures et les comorbidités associées sont estimées à 8,3 milliards de livres sterling en 2017-20182. Les blessures chroniques sont également actuellement un problème urgent aux États-Unis, avec l'assurance-maladie en estimant le coût annuel du traitement des patients atteints de blessures de 28,1 $ à 96,8 milliards de dollars3.
L'infection est un facteur majeur empêchant la cicatrisation des plaies. Les infections se manifestent souvent comme des biofilms, qui sont présents dans 78% des plaies chroniques non cicatrices. Les biofilms se forment lorsque les micro-organismes deviennent irréversiblement attachés aux surfaces, tels que les surfaces des plaies, et peuvent s'agréger pour former des communautés productrices de polymère extracellulaire (EPS). Le biofilm des plaies est associé à une réponse inflammatoire accrue conduisant à des lésions tissulaires, ce qui peut retarder ou prévenir la guérison4. L'augmentation des lésions tissulaires peut être due en partie à une activité accrue des métalloprotéinases matricielles, de la collagénase, de l'élastase et des espèces réactives de l'oxygène5. De plus, les cellules inflammatoires et les biofilms sont eux-mêmes des consommateurs élevés d'oxygène et peuvent donc provoquer une hypoxie tissulaire locale, épuisant les cellules de l'oxygène vital nécessaire pour une réparation de tissus efficace6.
Les biofilms matures sont très résistants aux agents antimicrobiens, nécessitant des stratégies agressives pour contrôler les infections du biofilm, telles que le traitement mécanique suivi d'un traitement antimicrobien efficace. Étant donné que les biofilms peuvent se régénérer rapidement, des antimicrobiens efficaces peuvent réduire le risque de réformation après le débridement chirurgical7.
L'argent est de plus en plus utilisé dans les pansements antimicrobiens et est souvent utilisé comme traitement de première intention pour les plaies infectées chroniques. Il existe de nombreux pansements en argent disponible dans le commerce, chacun contenant une composition argentée, une concentration et une matrice de base différentes. Les progrès des brassards en argent ont conduit au développement de nouveaux brassards en argent. La forme métallique de l'argent (AG0) est inerte; Pour atteindre l'efficacité antimicrobienne, il doit perdre un électron pour former de l'argent ionique (Ag1 +). Les pansements en argent traditionnels contiennent des composés argentés ou de l'argent métallique qui, lorsqu'il est exposé au liquide, se décompose pour former des ions Ag1 +. Ces ions Ag1 + réagissent avec la cellule bactérienne, éliminant les électrons des composants structurels ou des processus critiques nécessaires à la survie. La technologie brevetée a conduit au développement d'un nouveau composé en argent, Ag Oxysalts (Nitrate d'argent, Ag7No11), qui est inclus dans les pansements des plaies. Contrairement à l'argent traditionnel, la décomposition des sels contenant de l'oxygène produit des états d'argent avec une valence plus élevée (Ag1 +, Ag2 + et Ag3 +). Des études in vitro ont montré que de faibles concentrations de sels d'argent oxygénés sont plus efficaces que l'argent à ions uniques (Ag1 +) contre les bactéries pathogènes telles que Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Escherichia coli8,9. Un autre nouveau type de vinaigrette en argent comprend des ingrédients supplémentaires, à savoir l'acide éthylènediaminetraacétique (EDTA) et le chlorure de benzethonium (BC), qui ciblent les EPS du biofilm et augmentent ainsi la pénétration de l'argent dans le biofilm. Ces nouvelles technologies d'argent offrent de nouvelles façons de cibler les biofilms des plaies. Cependant, l'impact de ces antimicrobiens sur l'environnement des plaies et la guérison indépendante de l'infection est important pour s'assurer qu'ils ne créent pas un environnement de plaie défavorable ou ne retardant pas la guérison. Des inquiétudes concernant une cytotoxicité en argent in vitro ont été signalées avec plusieurs pansements en argent 10,11. Cependant, la cytotoxicité in vitro ne s'est pas encore traduite par une toxicité in vivo, et plusieurs pansements AG1 + ont démontré un bon profil de sécurité12.
Ici, nous avons étudié l'efficacité des pansements de carboxyméthylcellulose contenant de nouvelles formulations d'argent contre le biofilm des plaies in vitro et in vivo. De plus, les effets de ces pansements sur les réponses immunitaires et la guérison indépendants de l'infection ont été évalués.
Tous les pansements utilisés étaient disponibles dans le commerce. Vêtements de fibres de gel Kerracel 3M (3M, Knutsford, Royaume-Uni) est un pansement de fibres de gel non antimicrobien 100% carboxyméthylcellulose (CMC) qui a été utilisé comme pansement témoin dans cette étude. Trois pansements en argent CMC antimicrobiens ont été évalués, à savoir la vinaigrette Kerracel AG 3M (3M, Knutsford, Royaume-Uni), qui contient 1,7% en poids. sel d'argent oxygéné (AG7NO11) dans des ions argentés de valence plus élevés (Ag1 +, Ag2 + et Ag3 +). Pendant la décomposition des ions Ag7NO11, Ag1 +, Ag2 + et Ag3 + se forment dans un rapport de 1: 2: 4. Aquacel AG Dishage supplémentaire contenant 1,2% de chlorure d'argent (AG1 +) (Convatec, Deeside, UK) 13 et Aquacel AG + Dishargage supplémentaire contenant 1,2% de chlorure d'argent (AG1 +), EDTA et chlorure de benzethonium (Convatec, Deeside, UK) 14.
Les souches utilisées dans cette étude étaient Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) et Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Les bactéries ont été cultivées pendant la nuit dans un bouillon Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Royaume-Uni). La culture de nuit a ensuite été diluée 1: 100 dans le bouillon Mueller-Hinton et 200 µl plaqués sur des membranes stériles de 0,2 µm Whatman Cyclopore (Whatman Plc, Maidstone, UK) sur des plaques d'agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Grande-Bretagne ). ) Formation du biofilm colonial à 37 ° C pendant 24 heures. Ces biofilms coloniaux ont été testés pour le retrait logarithmique.
Coupez la vinaigrette en morceaux carrés de 3 cm2 et pré-montisten avec de l'eau déionisée stérile. Placez le bandage sur le biofilm de la colonie sur la plaque d'agar. Tous les 24 ha de biofilm ont été retirés et des bactéries viables dans le biofilm (CFU / ml) ont été quantifiées par dilution en série (10−1 à 10−7) dans le bouillon de neutralisation de l'angle de jour (Merck-Millipore). Après 24 heures d'incubation à 37 ° C, des dénombrements standard ont été effectués sur des plaques d'agar Mueller-Hinton. Chaque traitement et point temporel a été effectué en triple et le nombre de plaques a été répété pour chaque dilution.
La peau de poitrine de porc est obtenue de gros porcs blancs femelles dans les 15 minutes suivant l'abattage conformément aux normes d'exportation de l'Union européenne. La peau a été rasée et nettoyée avec des lingettes d'alcool, puis congelées à -80 ° C pendant 24 heures pour dévier la peau. Après dégel, des pièces de peau de 1 cm2 ont été lavées trois fois avec du PBS, 0,6% d'hypochlorite de sodium et de l'éthanol à 70% pendant 20 minutes à chaque fois. Avant de retirer l'épiderme, retirez tout éthanol restant en lavant 3 fois dans du PBS stérile. The skin was cultured in a 6-well plate with a 0.45-μm-thick nylon membrane (Merck-Millipore) on top and 3 absorbent pads (Merck-Millipore) containing 3 ml fetal bovine serum (Sigma) supplemented with 10% Dulbecco's modified Aigle. Medium (le milieu Eagle modifié de Dulbecco - Aldrich Ltd.).
Les biofilms coloniaux ont été cultivés comme décrit pour les études d'exposition au biofilm. Après avoir cultivé le biofilm sur la membrane pendant 72 heures, le biofilm a été appliqué à la surface de la peau à l'aide d'une boucle d'inoculation stérile et la membrane a été éliminée. Le biofilm a ensuite été incubé sur le derme du porc pendant 24 heures supplémentaires à 37 ° C pour permettre au biofilm de mûrir et d'adhérer à la peau du porc. Une fois le biofilm qui a mûri et attaché, un pansement de 1,5 cm2, pré-trié avec de l'eau distillée stérile, a été appliqué directement sur la surface de la peau et incubé à 37 ° C pendant 24 heures. Les bactéries viables ont été visualisées par coloration en appliquant uniformément un réactif de viabilité des cellules pré-bobus (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni) à la surface apicale de chaque explant et en l'incubant pendant 5 minutes. Utilisez l'appareil photo numérique Leica DFC425 pour capturer instantanément des images sur le microscope Leica MZ8. Les zones colorées roses ont été quantifiées à l'aide du logiciel Image Pro version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-PRO (MEDIACY.com)). La microscopie électronique à balayage a été réalisée comme décrit ci-dessous.
Les bactéries cultivées pendant la nuit ont été diluées 1: 100 dans le bouillon Mueller-Hinton. 200 μL de culture ont été ajoutés à une membrane stérile de 0,2 μm Whatman Cyclopore (Whatman, Maidstone, Royaume-Uni) et plaqué sur l'agar Mueller-Hinton. Les plaques de biofilm ont été incubées à 37 ° C pendant 72 heures pour permettre la formation de biofilm mature.
Après 3 jours de maturation de biofilm, un bandage carré de 3 cm2 a été placé directement sur le biofilm et incubé à 37 ° C pendant 24 heures. Après avoir retiré le bandage de la surface du biofilm, 1 ml de réactif de viabilité des cellules pré-bobus (Invitrogen, Waltham, MA) a été ajouté à la surface de chaque biofilm pendant 20 secondes. Les surfaces ont été séchées avant l'enregistrement des changements de couleur à l'aide d'un appareil photo numérique Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Royaume-Uni).
Préparez les cultures de nuit sur la gélose Mueller-Hinton, transférez des colonies individuelles dans un bouillon Mueller-Hinton de 10 ml et incubez sur un shaker à 37 ° C (100 tr / min). Après une incubation d'une nuit, la culture a été diluée 1: 100 dans le bouillon Mueller-Hinton et 300 µL a été repérée sur une membrane circulaire de Whatman Cyclopore de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Royaume-Uni) sur l'agar Mueller Hinton et incubée à 37 ° C en 72 heures . . Le biofilm mature a été appliqué à la plaie comme décrit ci-dessous.
Tous les travaux avec des animaux ont été réalisés à l'Université de Manchester en vertu d'une licence de projet approuvée par le Bureau du bien-être animal et de l'examen éthique (P8721BD27) et conformément aux directives publiées par le Home Office en vertu de l'ASPA révisée de 2012. Tous les auteurs ont adhéré aux directives d'arrivée. Des souris C57BL / 6J âgées de huit semaines (Envigo, Oxon, Royaume-Uni) ont été utilisées pour toutes les études in vivo. Les souris ont été anesthésiées avec l'isoflurane (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Royaume-Uni) et leurs surfaces dorsales ont été rasées et nettoyées. Chaque souris a ensuite reçu une blessure excisionnelle de 2 × 6 mm en utilisant un punch de biopsie de Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Royaume-Uni). Pour les plaies infectées par le biofilm, appliquez un biofilm colonial de 72 heures cultivé sur la membrane comme décrit ci-dessus à la couche dermique de la plaie à l'aide d'une boucle d'inoculation stérile immédiatement après la blessure et jetez la membrane. Un centimètre carré de vinaigrette est pré-trié avec de l'eau stérile pour maintenir un environnement de plaie humide. Les pansements ont été appliqués directement à chaque blessure et recouverts de film de TEGADERM 3M (3M, Bracknell, Royaume-Uni) et d'adhésif liquide de mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) s'est appliqué sur les bords pour fournir une adhérence supplémentaire. La buprénorphine (Animalcare, York, Royaume-Uni) a été administrée à une concentration de 0,1 mg / kg comme analgésique. Coupez les souris trois jours après la blessure en utilisant la méthode de l'annexe 1 et retirez, divisez de moitié et stockez la zone de la plaie au besoin.
La coloration à l'hématoxyline (ThermoFisher Scientific) et à l'éosine (ThermoFisher Scientific) a été effectuée selon le protocole du fabricant. La zone des plaies et la réépithélialisation ont été quantifiées à l'aide du logiciel Image Pro version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Les coupes de tissus ont été déwaxes dans du xylène (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Royaume-Uni), réhydratées avec de l'éthanol gradué de 100 à 50% et brièvement immergés dans de l'eau déionisée (Thermofisher Scientific). L'immunohistochimie a été réalisée à l'aide du kit Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) selon le protocole du fabricant. Les anticorps primaires contre les neutrophiles NIMP-R14 (ThermoFisher Scientific) et les macrophages MS CD107B pur M3 / 84 (BD Biosciences, Wokingham, Royaume-Uni) ont été dilués 1: 100 en solution de blocage et ajoutés à la surface coupée, suivie de 2 anticorps anti-anti-Vectastain Kit de substrat ABC et Vector Nova Red Perroxydase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et contre-coloré avec l'hématoxyline. Des images ont été acquises à l'aide d'un microscope Olympus BX43 et d'un appareil photo numérique Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Royaume-Uni).
Les échantillons de peau ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5% et à 4% de formaldéhyde dans 0,1 M HEPES (pH 7,4) pendant 24 heures à 4 ° C. Les échantillons ont été déshydratés en utilisant de l'éthanol gradué et séchés dans du CO2 à l'aide d'un séchoir de points critiques au quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Royaume-Uni) et enrobés de la pulvérisation d'alliage d'or-palladium à l'aide d'un système de décharge Sputter / Glow de quorum SC7620. Les échantillons ont été imagés à l'aide d'un microscope électronique à balayage FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) pour visualiser le point central de la plaie.
L'iodure Toto-1 (2 μM) a été appliqué à la surface de la plaie de la souris excisée et incubé pendant 5 min à 37 ° C (ThermoFisher Scientific) et traité avec Syto-60 (10 μm) à 37 ° C (Thermofisher Scientific). Des images de pile Z de 15 minutes ont été créées à l'aide d'un Leica TCS SP8.
Les données de réplication biologique et technique ont été tabulées et analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Une analyse de variance unidirectionnelle avec des comparaisons multiples en utilisant le test post hoc de Dunnett a été utilisée pour tester les différences entre chaque traitement et le pansement de contrôle non antimicrobien. Une valeur p <0,05 a été considérée comme significative.
L'efficacité des pansements fibreux en gel d'argent a d'abord été évalué par rapport aux colonies de biofilm de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa in vitro. Les pansements en argent contiennent différentes formules d'argent: les pansements en argent traditionnels produisent des ions Ag1 +; Les pansements en argent, qui peuvent produire des ions Ag1 + après l'ajout d'EDTA / BC, peuvent détruire la matrice de biofilm et exposer les bactéries à l'argent sous l'effet antibactérien de l'argent. Ions15 et pansements contenant des sels AG oxygénés qui produisent des ions Ag1 +, Ag2 + et Ag3 +. Son efficacité a été comparée à un pansement de contrôle non antimicrobien fabriqué à partir de fibres gélifiées. Les bactéries viables restantes dans le biofilm ont été évaluées toutes les 24 heures pendant 8 jours (figure 1). Le jour 5, le biofilm a été réinoculé avec 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus ou 1,22 × 105p. Aeruginosa pour évaluer la récupération du biofilm. Par rapport aux pansements de contrôle non antimicrobiens, les pansements AG1 + ont eu un effet minimal sur la viabilité bactérienne dans les biofilms de Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa sur 5 jours. En revanche, les pansements contenant des sels Ag oxygénés et AG1 + + EDTA / BC ont été efficaces pour tuer les bactéries dans le biofilm dans les 5 jours. Après inoculation répétée avec des bactéries planctoniques au jour 5, aucune restauration du biofilm n'a été observée (Fig. 1).
Quantification des bactéries viables dans les biofilms de Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa après traitement avec des pansements en argent. Les colonies de biofilms de Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa ont été traitées avec des pansements en argent ou des pansements de contrôle non antimicrobiens, et le nombre de bactéries viables restantes a été déterminée toutes les 24 heures. Après 5 jours, le biofilm a été réinoculé avec 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus ou 1,22 × 105p. Les colonies du bactérioplancton pseudomonas aeruginosa ont été formées individuellement pour évaluer la récupération du biofilm. Les graphiques montrent une erreur standard moyenne +/-.
Pour visualiser l'effet des pansements en argent sur la viabilité du biofilm, des pansements ont été appliqués sur des biofilms matures cultivés sur la peau porcine ex vivo. Après 24 heures, le pansement est retiré et le biofilm est coloré avec un colorant réactif bleu, qui est métabolisé par des bactéries vivantes à une couleur rose. Les biofilms traités avec des pansements témoins étaient roses, indiquant la présence de bactéries viables dans le biofilm (figure 2A). En revanche, le biofilm traité avec la vinaigrette AG Oxysols était principalement bleu, indiquant que les bactéries restantes à la surface de la peau du porc étaient des bactéries non viables (figure 2B). Une coloration bleu et rose mélangée a été observée dans les biofilms traités avec des pansements contenant Ag1 +, indiquant la présence de bactéries viables et non viables dans le biofilm (figure 2C), tandis que les pansements EDTA / BC contenant Ag1 + étaient principalement bleus avec des taches roses. indiquant les zones non affectées par le pansement en argent (figure 2D). La quantification des zones actives (roses) et inactives (bleues) a montré que le patch témoin était actif à 75% (figure 2E). Les pansements AG1 + + EDTA / BC se sont effectués de manière similaire aux pansements au sel AG oxygénés, avec des taux de survie de 13% et 14%, respectivement. Le pansement AG1 + a également réduit la viabilité bactérienne de 21%. Ces biofilms ont ensuite été observés en utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM). Après traitement avec le pansement témoin et la vinaigrette AG1 +, une couche de Pseudomonas aeruginosa a été observée couvrant la peau porcin (figure 2F, H), alors qu'après le traitement avec la vinaigrette Ag1 +, peu de cellules bactériennes ont été trouvées et quelques cellules bactériennes ont été trouvées en dessous. Les fibres de collagène peuvent être considérées comme la structure tissulaire de la peau porcin (figure 2G). Après traitement avec un pansement AG1 + + EDTA / BC, des plaques bactériennes et des plaques de fibre de collagène sous-jacentes étaient visibles (figure 2i).
Visualisation du biofilm de Pseudomonas aeruginosa après traitement de pansement en argent. (A - D) La viabilité bactérienne dans les biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivées sur la peau porcine a été visualisée en utilisant un colorant de viabilité pré-bobe 24 heures après le traitement avec des pansements en argent ou des pansements de contrôle non antimicrobiens. Les bactéries vivantes sont roses, les bactéries non viables et la peau de porc sont bleues. (E) Quantification des biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivés sur la peau porcin (tache rose) à l'aide de la microscopie électronique à balayage Image Pro version 10 (FI) et traitée avec un pansement en argent ou un pansement de contrôle non antimicrobien pendant 24 heures. Bar à échelle SEM = 5 µm. (J - M) Les biofilms coloniaux se sont développés sur des filtres et ont été colorés avec un colorant réactif préalable après 24 h d'incubation avec des pansements en argent.
Pour déterminer si un contact étroit entre les pansements et les biofilms a affecté l'efficacité des pansements, les biofilms coloniaux placés sur une surface plane ont été traités avec les pansements pendant 24 heures puis tachés avec des colorants réactifs. Le biofilm non traité était de couleur rose foncé (figure 2J). Contrairement aux biofilms traités avec des pansements contenant des sels AG oxygénés (figure 2K), les biofilms traités avec des pansements contenant Ag1 + ou Ag1 + + EDTA / BC ont montré des bandes de coloration rose (figure 2L, M). Cette coloration rose indique la présence de bactéries viables et est associée à la zone de suture dans le pansement. Ces zones cousues créent des espaces morts qui permettent aux bactéries du biofilm de survivre.
Pour évaluer l'efficacité des pansements en argent in vivo, les blessures excisées à pleine épaisseur de souris infectées par des biofilms matures de S. aureus et de P. aeruginosa ont été traitées avec des pansements de contrôle non antimicrobiens ou des pansements en argent. Après 3 jours de traitement, l'analyse d'image macroscopique a montré des tailles de plaies plus petites lorsqu'elles sont traitées avec des pansements de sel oxygénés par rapport aux pansements de contrôle non antimicrobiens et autres pansements en argent (figure 3A-H). Pour confirmer ces observations, les plaies ont été récoltées et une zone de blessure et la réépithélialisation a été quantifiée sur des coupes de tissus colorés à l'hématoxyline et à l'éosine à l'aide du logiciel Image Pro version 10 (figure 3i-L).
L'effet des pansements en argent sur la surface de la plaie et réépithélialisation des plaies infectées par des biofilms. (A - H) petites cellules infectées par des biofilms de Pseudomonas aeruginosa (A - D) et de Staphylococcus aureus (E - H) après trois jours de traitement par un pansement témoin non antimicrobien, un pansement AG oxygéné, un pansement AG1 + et un AG1 + pansement. Images macroscopiques représentatives. blessures de souris avec vinaigrette AG1 + + EDTA / BC. (IL) Infection représentative de Pseudomonas aeruginosa, coupes histologiques colorées à l'hématoxyline et à l'éosine, utilisées pour quantifier la zone de la plaie et la régénération épithéliale. Quantification de la zone de la plaie (M, O) et du pourcentage de réépithélialisation (N, P) des plaies infectées par Pseudomonas aeruginosa (M, N) et Staphylococcus aureus (O, P) biofilms (par groupe de traitement n = 12). Les graphiques montrent une erreur standard moyenne +/-. * signifie p = <0,05 ** signifie p = <0,01; Échelle macroscopique = 2,5 mm, échelle histologique = 500 µm.
La quantification de la zone des plaies chez les plaies infectées par le biofilm de Pseudomonas aeruginosa (figure 3M) a montré que les plaies traitées avec des oxysaltes Ag avaient une taille moyenne de la plaie de 2,5 mm2, tandis que le pansement de contrôle non antimicrobien avait une taille de plaie moyenne de 3,1 mm2, qui n'est pas vrai. a atteint la signification statistique (figure 3M). p = 0,423). Les plaies traitées avec AG1 + ou AG1 + + EDTA / BC n'ont montré aucune réduction de la zone de la plaie (3,1 mm2 et 3,6 mm2, respectivement). Traitement avec un pansement AG oxygéné a favorisé la réépithélialisation dans une plus grande mesure que le pansement témoin non antimicrobien (34% et 15%, respectivement; P = 0,029) et AG1 + ou AG1 + + EDTA / BC (10% et 11%) ( Figure 3N). . , respectivement).
Des tendances similaires dans la zone des plaies et la régénération épithéliale ont été observées chez les blessures infectées par des biofilms de S. aureus (figure 3O). Les pansements contenant des sels d'argent oxygénés ont réduit la zone de la plaie (2,0 mm2) par 23% par rapport au pansement témoin non antimicrobien (2,6 mm2), bien que cette réduction n'ait pas été significative (p = 0,304) (Fig. 3O). De plus, la zone de la plaie du groupe de traitement AG1 + a été légèrement réduite (2,4 mm2), tandis que la plaie traitée avec un pansement AG1 + + EDTA / BC n'a pas réduit la zone de la plaie (2,9 mm2). Les sels d'oxygène d'Ag ont également favorisé la réépithélialisation des plaies infectées par le biofilm de S. aureus (31%) dans une plus grande mesure que celles traitées avec des pansements témoins non antimicrobiens (12%, p = 0,003) (figure 3P). Le pansement AG1 + (16%, p = 0,903) et le pansement AG + 1 + EDTA / BC (14%, p = 0,965) ont montré des niveaux de régénération épithéliale similaires au contrôle.
Pour visualiser l'effet des pansements en argent sur la matrice de biofilm, la coloration à l'iodure TOTO 1 et SYTO 60 a été effectuée (Fig. 4). L'iodure TOTO 1 est un colorant imperméable aux cellules qui peut être utilisé pour visualiser avec précision les acides nucléiques extracellulaires, qui sont abondants dans l'EPS des biofilms. Syto 60 est un colorant perméable de cellule utilisé comme contre-étage16. Les observations d'iodure TOTO 1 et SYTO 60 dans les plaies inoculées avec des biofilms de Pseudomonas aeruginosa (figure 4A-D) et Staphylococcus aureus (figure 4I-L) ont montré qu'après 3 jours de traitement, l'EPS dans le biofilm était significativement réduit. contenant des sels oxygénés AG et AG1 + + EDTA / BC. Les pansements AG1 + sans composants antibiofilm supplémentaires ont considérablement réduit l'ADN sans cellules dans les plaies inoculées avec Pseudomonas aeruginosa mais étaient moins efficaces dans les plaies inoculées avec Staphylococcus aureus.
Imagerie in vivo du biofilm des plaies après 3 jours de traitement avec des pansements témoins ou en argent. Images confocales de Pseudomonas aeruginosa (A - D) et de Staphylococcus aureus (I - L) colorées avec TOTO 1 (vert) pour visualiser les acides nucléiques extracellulaires, un composant des polymères de biofilm extracellulaires. Pour colorer les acides nucléiques intracellulaires, utilisez Syto 60 (rouge). acides. P. Microscopie électronique à balayage des plaies infectées par Pseudomonas aeruginosa (E - H) et Staphylococcus aureus (M - P) Biofilms après 3 jours de traitement avec des pansements témoins et en argent. Bar à échelle SEM = 5 µm. Barre d'échelle d'imagerie confocale = 50 µm.
La microscopie électronique à balayage a montré que les souris inoculées avec des colonies de biofilm de Pseudomonas aeruginosa (figure 4E-H) et Staphylococcus aureus (figure 4m-p) avaient beaucoup moins de bactéries dans leurs plaies après 3 jours de traitement avec tous les pansements d'argent.
Pour évaluer l'effet des pansements d'argent sur l'inflammation des plaies chez les souris infectées par le biofilm, les sections de plaies infectées par le biofilm traitées avec des pansements témoins ou en argent pendant 3 jours ont été colorés immunohistochimiquement à l'aide d'anticorps spécifiques aux neutrophiles et aux macrophages. Détermination quantitative des neutrophiles et des macrophages en interne. tissu de granulation. Figure 5). Tous les pansements en argent ont réduit le nombre de neutrophiles et de macrophages dans les plaies infectées par Pseudomonas aeruginosa par rapport aux pansements témoins non antimicrobiens après trois jours de traitement. Cependant, le traitement avec le pansement en argent oxygéné a entraîné une réduction plus élevée des neutrophiles (p = <0,0001) et des macrophages (p = <0,0001) par rapport aux autres pansements en argent testés (figure 5I, J). Bien que Ag1 + + EDTA / BC ait eu un effet plus important sur le biofilm des plaies, il a réduit les niveaux de neutrophiles et de macrophages dans une moindre mesure que le pansement AG1 +. Des plaies modérées infectées par le biofilm de S. aureus ont également été observées après s'habiller avec AG (P = <0,0001), AG1 + (P = 0,0008) et Ag1 ++ EDTA / BC (P = 0,0043) oxisols par rapport au contrôle. Des tendances similaires sont observées pour la neutropénie. Bandage (Fig. 5K). Cependant, seul le pansement AG oxygéné a montré une réduction significative du nombre de macrophages dans le tissu de granulation par rapport au contrôle des plaies infectées par des biofilms de S. aureus (p = 0,0339) (figure 5L).
Les neutrophiles et les macrophages ont été quantifiés chez les plaies infectées par des biofilms de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus après 3 jours de traitement par contrôle non antimicrobien ou pansements d'argent. Les neutrophiles (AD) et les macrophages (EH) ont été quantifiés dans des coupes tissulaires colorées avec des anticorps spécifiques des neutrophiles ou des macrophages. Quantification des neutrophiles (I et K) et des macrophages (J et L) dans les plaies infectées par Pseudomonas aeruginosa (I et J) et Staphylococcus aureus (K&L). N = 12 par groupe. Les graphiques affichent une erreur standard moyenne +/-, les valeurs de signification par rapport au pansement de contrôle non antibactérien, * signifie p = <0,05, ** signifie p = <0,01; *** signifie p = <0,001; indique p = <0,0001).
Nous avons ensuite évalué l'effet des pansements en argent sur la guérison indépendante des infections. Les plaies excisionnelles non infectées ont été traitées avec un pansement de contrôle non antimicrobien ou un pansement en argent pendant 3 jours (figure 6). Parmi les pansements en argent testés, seuls les blessures traitées avec le pansement à sel oxygéné semblaient plus petites sur des images macroscopiques que les plaies traitées avec le contrôle (figure 6A-D). La quantification de la zone des plaies en utilisant une analyse histologique a montré que la zone de plaie moyenne après traitement avec le pansement AG Oxysols était de 2,35 mm2 contre 2,96 mm2 pour les plaies traitées avec le groupe témoin, mais cette différence n'a pas atteint une signification statistique (p = 0,488) (Fig . En revanche, aucune réduction de la zone de la plaie n'a été observée après traitement avec AG1 + (3,38 mm2, p = 0,757) ou AG1 + + EDTA / BC (4,18 mm2, p = 0,054) par rapport au groupe témoin. Une régénération épithéliale accrue a été observée avec le pansement AG Oxysol par rapport au groupe témoin (30% contre 22%, respectivement), bien que cela n'ait pas atteint la signification (P = 0,067), ceci est assez significatif et confirme les résultats précédents. Une vinaigrette avec des oxysols favorise la réépithélialisation. -Pithélisation des blessures non infectées17. En revanche, le traitement avec les pansements AG1 + ou AG1 + + EDTA / BC n'a eu aucun effet ou a montré une réépithélialisation diminuée par rapport au contrôle.
Effet du pansement en argent sur la cicatrisation des plaies chez des souris non infectées avec une résection complète. (AD) Images macroscopiques représentatives de blessures après trois jours de traitement avec un pansement de contrôle non antimicrobien et un pansement en argent. (EH) Sections de plaies représentatives colorées à l'hématoxyline et à l'éosine. La quantification de la zone de la plaie (I) et le pourcentage de réépithélialisation (j) ont été calculées à partir de coupes histologiques au milieu de la plaie à l'aide du logiciel d'analyse d'image (n = 11–12 par groupe de traitement). Les graphiques montrent une erreur standard moyenne +/-. * signifie p = <0,05.
L'argent a une longue histoire d'utilisation comme traitement antimicrobien dans la cicatrisation des plaies, mais les nombreuses formulations et méthodes d'administration différentes peuvent entraîner des différences d'efficacité antimicrobienne 18. De plus, les propriétés antibiofilm de systèmes de livraison d'argent spécifiques ne sont pas entièrement comprises. Bien que la réponse immunitaire de l'hôte soit relativement efficace contre les bactéries planctoniques, elle est généralement moins efficace contre les biofilms19. Les bactéries planctoniques sont facilement phagocytées par des macrophages, mais dans les biofilms, les cellules agrégées posent des problèmes supplémentaires en limitant la réponse de l'hôte dans la mesure où les cellules immunitaires peuvent subir une apoptose et libérer des facteurs pro-inflammatoires pour améliorer la réponse immunitaire20. Il a été observé que certains leucocytes peuvent pénétrer les biofilms21 mais ne sont pas en mesure de phagocytose les bactéries une fois cette défense compromise22. Une approche holistique doit être utilisée pour soutenir la réponse immunitaire de l'hôte contre l'infection du biofilm des plaies. Le débridement de la plaie peut perturber physiquement le biofilm et éliminer la plupart des bioburden, mais la réponse immunitaire de l'hôte peut être inefficace contre le biofilm restant, surtout si la réponse immunitaire de l'hôte est compromise. Ainsi, les thérapies antimicrobiennes telles que les pansements en argent peuvent soutenir la réponse immunitaire de l'hôte et éliminer les infections du biofilm. La composition, la concentration, la solubilité et le substrat d'administration peuvent influencer l'efficacité antimicrobienne de l'argent. Ces dernières années, les progrès de la technologie de traitement de l'argent ont rendu ces pansements plus efficaces 9,23. À mesure que la technologie des pansements d'argent progresse, il est important de comprendre l'efficacité de ces pansements dans le contrôle de l'infection des plaies et, plus important encore, de l'impact de ces puissantes formes d'argent sur l'environnement et la guérison des plaies.
Dans cette étude, nous avons comparé l'efficacité de deux pansements d'argent avancés avec des pansements en argent conventionnels qui produisent des ions Ag1 + contre les biofilms en utilisant différents modèles in vitro et in vivo. Nous avons également évalué l'effet de ces pansements sur l'environnement des plaies et la guérison indépendante de l'infection. Pour minimiser l'influence de la matrice de livraison, tous les pansements en argent testés ont été composés de carboxyméthylcellulose.
Our preliminary evaluation of these silver dressings against colonial biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus shows that, unlike traditional Ag1+ dressings, two advanced silver dressings, Ag1+ + EDTA/BC and oxygenated Ag salts, are effective at 5. Effectively killing biofilm bacteria in within quelques jours. De plus, ces pansements empêchent la reformation du biofilm lors d'une exposition répétée aux bactéries planctoniques. Le pansement AG1 + contenait du chlorure d'argent, le même composé d'argent et la même matrice de base que AG1 + + EDTA / BC, et a eu un effet limité sur la viabilité bactérienne dans le biofilm au cours de la même période. L'observation selon laquelle un pansement AG1 + + EDTA / BC était plus efficace contre le biofilm qu'un pansement AG1 + composé de la même matrice et d'un composé d'argent soutient la notion que des ingrédients supplémentaires sont nécessaires pour augmenter l'efficacité du chlorure d'argent contre le biofilm, comme cela a été indiqué ailleurs 15. Ces résultats soutiennent l'idée que la Colombie-Britannique et l'EDTA jouent un rôle supplémentaire contribuant à l'efficacité globale du pansement et que l'absence de cette composante dans les pansements AG1 + peut avoir contribué à l'échec de la démonstration de l'efficacité in vitro. Nous avons constaté que les pansements de sel AG oxygénés produisant des ions Ag2 + et Ag3 + présentaient une efficacité antibactérienne plus forte que Ag1 + et à des niveaux similaires à Ag1 + + EDTA / BC. Cependant, en raison du potentiel redox élevé, il n'est pas clair combien de temps les ions Ag3 + restent actifs et efficaces contre les biofilms des plaies et méritent donc une étude plus approfondie. De plus, il existe de nombreux pansements différents qui génèrent des ions Ag1 + qui n'ont pas été testés dans cette étude. Ces pansements sont composés de différents composés d'argent, concentrations et matrices de base, qui peuvent influencer la livraison d'ions Ag1 + et leur efficacité contre les biofilms. Il convient également de noter qu'il existe de nombreux modèles différents et in vivo utilisés pour évaluer l'efficacité des pansements des plaies contre les biofilms. Le type de modèle utilisé, ainsi que la teneur en sel et en protéines des milieux utilisés dans ces modèles, influenceront l'efficacité du pansement. Dans notre modèle in vivo, nous avons permis au biofilm de mûrir in vitro, puis de les transférer à la surface cutanée de la plaie. La réponse immunitaire de la souris hôte est relativement efficace contre les bactéries planctoniques appliquées à la plaie, formant ainsi un biofilm lorsque la plaie guérisse. L'ajout de biofilm mature à une plaie limite l'efficacité de la réponse immunitaire de l'hôte à la formation de biofilm en permettant au biofilm mature de s'établir dans la plaie avant la guérison peut commencer. Ainsi, notre modèle nous permet d'évaluer l'efficacité des pansements antimicrobiens sur les biofilms matures avant que les plaies ne commencent à guérir.
Nous avons également constaté que la pansement a influencé l'efficacité des pansements en argent sur les biofilms in vitro et la peau porcine. Un contact étroit avec la plaie est considéré comme critique pour l'efficacité antimicrobienne de la pansement24,25. Les pansements contenant des sels AG oxygénés étaient en contact étroit avec des biofilms matures, entraînant une réduction significative du nombre de bactéries viables dans le biofilm après 24 heures. En revanche, lorsqu'il est traité avec des pansements AG1 + et AG1 + + EDTA / BC, un nombre significatif de bactéries viables est restée. Ces pansements contiennent des sutures sur toute la longueur du pansement, ce qui crée des espaces morts qui empêchent un contact étroit avec le biofilm. Dans nos études in vitro, ces zones sans contact ont empêché le meurtre de bactéries viables dans le biofilm. Nous n'avons évalué la viabilité bactérienne qu'après 24 heures de traitement; Au fil du temps, à mesure que le pansement devient plus saturé, il peut y avoir moins d'espace mort, réduisant la zone de ces bactéries viables. Cependant, cela met en évidence l'importance de la composition du pansement, pas seulement le type d'argent dans le pansement.
Bien que les études in vitro soient utiles pour comparer l'efficacité de différentes technologies d'argent, il est également important de comprendre les effets de ces pansements sur les biofilms in vivo, où les tissus hôtes et les réponses immunitaires contribuent à l'efficacité des pansements contre les biofilms. L'effet de ces pansements sur les biofilms des plaies a été observé en utilisant la microscopie électronique à balayage et la coloration EPS du biofilm en utilisant des colorants d'ADN intracellulaires et extracellulaires. Nous avons constaté qu'après 3 jours de traitement, tous les pansements ont été efficaces pour réduire l'ADN sans cellules dans les plaies infectées par le biofilm, mais le pansement AG1 + était moins efficace chez les plaies infectées par Staphylococcus aureus. La microscopie électronique à balayage a également montré que significativement moins de bactéries étaient présentes dans les plaies traitées avec les pansements en argent, bien que cela ait été plus prononcé avec le vinaigrette à sel AG oxygéné et le pansement AG1 + + EDTA / BC par rapport à la vinaigrette AG1 +. Ces données montrent que les pansements en argent testés ont eu divers degrés d'impact sur la structure du biofilm, mais aucun des pansements en argent n'a pu éradiquer le biofilm, soutenant la nécessité d'une approche holistique du traitement des infections du biofilm des plaies; Utilisation de brassards argentés. Le traitement est précédé d'un débridement physique pour éliminer la majeure partie du biofilm.
Les plaies chroniques sont souvent dans un état d'inflammation sévère, avec des cellules inflammatoires excessives restant dans le tissu des plaies pendant une longue période, provoquant des lésions tissulaires et épuisant l'oxygène nécessaire à un métabolisme cellulaire efficace et à la fonction dans la blessure26. Les biofilms exacerbent cet environnement de plaie hostile en affectant négativement la guérison de diverses manières, notamment l'inhibition de la prolifération cellulaire et de la migration et de l'activation des cytokines pro-inflammatoires27. À mesure que les pansements en argent deviennent plus efficaces, il est important de comprendre l'impact qu'ils ont sur l'environnement des plaies et la guérison.
Fait intéressant, bien que tous les pansements en argent affectent la composition du biofilm, seuls les pansements en sel en argent oxygéné ont augmenté la réépithélialisation de ces plaies infectées. Ces données soutiennent nos résultats précédents17 et ceux de Kalan et al. (2017) 28, qui a démontré de bons profils de sécurité et de toxicité des sels d'argent oxygénés, car des concentrations plus faibles d'argent étaient efficaces contre les biofilms.
Notre étude actuelle met en évidence les différences de technologie de l'argent entre les pansements en argent antimicrobien et l'impact de cette technologie sur l'environnement des plaies et la guérison indépendante de l'infection. Cependant, ces résultats diffèrent des études précédentes montrant que le pansement AG1 + + EDTA / BC a amélioré les paramètres de guérison des oreilles de lapin blessées in vivo. Cependant, cela peut être dû aux différences dans les modèles animaux, les temps de mesure et les méthodes d'application bactérienne29. Dans ce cas, les mesures des plaies ont été prises 12 jours après une blessure pour permettre aux ingrédients actifs de la vinaigrette d'agir sur le biofilm sur une période plus longue. Ceci est soutenu par une étude qui a montré que les ulcères de jambe infectés cliniquement traités avec Ag1 + + EDTA / BC augmentaient initialement en taille après une semaine de traitement, puis au cours des 3 prochaines semaines de traitement avec AG1 + + EDTA / BC et dans les 4 semaines suivant Utilisation de non-antimicrobiens. drogues. Dressements CMC pour réduire la taille des ulcères30.
Certaines formes et concentrations d'argent se sont précédemment révélées être cytotoxiques in vitro 11, mais ces résultats in vitro ne se traduisent pas toujours par des effets indésirables in vivo. De plus, les progrès de la technologie de l'argent et une meilleure compréhension des composés argentés et des concentrations dans les pansements ont conduit au développement de nombreux pansements en argent sûrs et efficaces. Cependant, à mesure que la technologie de pansement en argent progresse, il est important de comprendre l'impact de ces pansements sur l'environnement des plaies 31,32,33. Il a été précédemment rapporté que l'augmentation du taux de réépithélialisation correspond à une proportion accrue de macrophages M2 anti-inflammatoires par rapport au phénotype M1 pro-inflammatoire. Cela a été noté dans un modèle de souris précédent où les pansements en plaie hydrogel en argent ont été comparés à la sulfadiazine d'argent et à des hydrogels non antimicrobiens34.
Les plaies chroniques peuvent présenter une inflammation excessive et il a été observé que la présence de neutrophiles en excès peut être préjudiciable à la cicatrisation des plaies35. Dans une étude chez les souris appauvri par neutrophiles, la présence de neutrophiles a retardé la réépithélialisation. La présence d'excès de neutrophiles entraîne des niveaux élevés de protéases et d'espèces réactives de l'oxygène, telles que le superoxyde et le peroxyde d'hydrogène, qui sont associées à des plaies chroniques et à guérison lente37,38. De même, une augmentation des nombres de macrophages, s'il est incontrôlé, peut entraîner une cicatrisation des plaies retardée39. Cette augmentation est particulièrement importante si les macrophages sont incapables de passer d'un phénotype pro-inflammatoire à un phénotype pro-cicatrisation, entraînant des blessures qui ne sortaient pas de la phase inflammatoire de la guérison40. Nous avons observé une diminution des neutrophiles et des macrophages des plaies infectées par le biofilm après 3 jours de traitement avec tous les pansements en argent, mais la diminution a été plus prononcée avec des pansements de sel oxygénés. Cette diminution peut être le résultat direct de la réponse immunitaire à l'argent, une réponse à une diminution des bioburden, ou la plaie étant à un stade ultérieur de guérison et donc les cellules immunitaires dans la plaie réduite. La réduction du nombre de cellules inflammatoires dans la plaie peut maintenir un environnement propice à la cicatrisation des plaies. Le mécanisme d'action de la façon dont les oxysaltes AG favorisent la guérison indépendante des infections n'est pas clair, mais la capacité des oxysaltes Ag à produire de l'oxygène et à détruire les niveaux nocifs de peroxyde d'hydrogène, un médiateur de l'inflammation, peut expliquer cela et nécessite une étude plus approfondie17.
Les plaies chroniques infectées non de guérison posent un problème pour les médecins et les patients. Bien que de nombreux pansements affirment l'efficacité des antimicrobiens, la recherche se concentre rarement sur d'autres facteurs clés influençant le microenvironnement des plaies. Cette étude montre que différentes technologies d'argent ont une efficacité antimicrobienne différente et, surtout, des effets différents sur l'environnement et la guérison des plaies, indépendamment de l'infection. Bien que ces études in vitro et in vivo montrent l'efficacité de ces pansements dans le traitement des infections des plaies et la promotion de la guérison, des essais contrôlés randomisés sont nécessaires pour évaluer l'efficacité de ces pansements en clinique.
Les ensembles de données utilisés et / ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur une demande raisonnable.