Effet anti-biofilm et stimulation de la cicatrisation des pansements au nitrate d'argent

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La prolifération microbienne dans les plaies se manifeste souvent sous forme de biofilms, qui entravent la cicatrisation et sont difficiles à éradiquer. De nouveaux pansements à base d'argent prétendent combattre les infections des plaies, mais leur efficacité antibiofilm et leurs effets cicatrisants indépendants de l'infection restent généralement inconnus. À l'aide de modèles de biofilms in vitro et in vivo de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa, nous rapportons l'efficacité de pansements générateurs d'ions Ag1+ : des pansements Ag1+ contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique et du chlorure de benzéthonium (Ag1+/EDTA/BC), et des pansements contenant du nitrate d'argent (oxysels d'argent). Ces pansements produisent des ions Ag1+, Ag2+ et Ag3+ pour combattre le biofilm et son impact sur la cicatrisation. Les pansements Ag1+ ont eu des effets minimes sur le biofilm in vitro et chez la souris (C57BL/6j). En revanche, les pansements à base de sels d'argent oxygénés et d'Ag1+/EDTA/BC ont réduit significativement le nombre de bactéries viables dans les biofilms in vitro et ont démontré une réduction significative des composants bactériens et des EPS dans les biofilms de plaies chez la souris. Ces pansements ont eu des effets différents sur la cicatrisation des plaies infectées et non infectées par un biofilm. Les pansements à base de sels oxygénés ont eu des effets plus bénéfiques sur la réépithélialisation, la taille de la plaie et l'inflammation que les traitements témoins et les autres pansements à base d'argent. Les différentes propriétés physico-chimiques des pansements à base d'argent peuvent avoir des effets différents sur le biofilm et la cicatrisation, et il convient d'en tenir compte lors du choix d'un pansement pour le traitement des plaies infectées par un biofilm.
Les plaies chroniques sont définies comme « des plaies qui ne progressent pas selon les étapes normales de cicatrisation de manière ordonnée et dans les délais impartis »¹. Elles représentent un fardeau psychologique, social et économique pour les patients et le système de santé. Les dépenses annuelles du NHS consacrées au traitement des plaies et des comorbidités associées étaient estimées à 8,3 milliards de livres sterling en 2017¹⁸². Aux États-Unis, les plaies chroniques constituent également un problème majeur : Medicare estime le coût annuel du traitement des patients atteints de plaies entre 28,1 et 96,8 milliards de dollars³.
L'infection est un facteur majeur de ralentissement de la cicatrisation. Elle se manifeste souvent par la formation de biofilms, présents dans 78 % des plaies chroniques ne cicatrisant pas. Les biofilms se forment lorsque des micro-organismes adhèrent de manière irréversible à des surfaces, comme celles de la plaie, et peuvent s'agréger pour former des communautés productrices de polymères extracellulaires (EPS). La présence de biofilms dans les plaies est associée à une réponse inflammatoire accrue, entraînant des lésions tissulaires susceptibles de retarder, voire d'empêcher, la cicatrisation⁴. Cette augmentation des lésions tissulaires peut être due, en partie, à une activité accrue des métalloprotéinases matricielles, de la collagénase, de l'élastase et des espèces réactives de l'oxygène⁵. De plus, les cellules inflammatoires et les biofilms sont eux-mêmes de grands consommateurs d'oxygène et peuvent donc provoquer une hypoxie tissulaire locale, privant ainsi les cellules de l'oxygène vital nécessaire à une réparation tissulaire efficace⁶.
Les biofilms matures sont très résistants aux agents antimicrobiens, ce qui exige des stratégies agressives pour contrôler les infections à biofilm, telles qu'un traitement mécanique suivi d'un traitement antimicrobien efficace. Étant donné que les biofilms peuvent se régénérer rapidement, des antimicrobiens efficaces peuvent réduire le risque de récidive après débridement chirurgical⁷.
L'argent est de plus en plus utilisé dans les pansements antimicrobiens et constitue souvent un traitement de première intention pour les plaies chroniques infectées. De nombreux pansements à base d'argent sont disponibles sur le marché, chacun présentant une composition, une concentration et une matrice de base différentes. Les progrès réalisés dans le domaine des bracelets d'argent ont permis le développement de nouveaux modèles. L'argent métallique (Ag⁰) est inerte ; pour acquérir une efficacité antimicrobienne, il doit céder un électron et former de l'argent ionique (Ag⁺). Les pansements à base d'argent traditionnels contiennent des composés d'argent ou de l'argent métallique qui, au contact d'un liquide, se décomposent pour former des ions Ag⁺. Ces ions Ag⁺ réagissent avec la cellule bactérienne, lui arrachant des électrons de ses composants structuraux ou de ses processus vitaux. Une technologie brevetée a permis la mise au point d'un nouveau composé d'argent, l'oxysel d'argent (nitrate d'argent, Ag₇NO₁₁), qui entre dans la composition des pansements. Contrairement à l'argent traditionnel, la décomposition de ces sels oxygénés produit des états d'oxydation de l'argent plus élevés (Ag⁺, Ag²⁺ et Ag³⁺). Des études in vitro ont montré que de faibles concentrations de sels d'argent oxygénés sont plus efficaces que l'argent ionique (Ag1+) contre des bactéries pathogènes telles que Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Escherichia coli^8,9. Un autre type de pansement à base d'argent contient des ingrédients supplémentaires, notamment l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et le chlorure de benzéthonium (BC), qui ciblent la matrice extracellulaire (EPS) du biofilm et augmentent ainsi la pénétration de l'argent dans celui-ci. Ces nouvelles technologies à base d'argent offrent de nouvelles approches pour cibler les biofilms des plaies. Cependant, il est important d'évaluer l'impact de ces antimicrobiens sur l'environnement de la plaie et la cicatrisation indépendante de l'infection afin de s'assurer qu'ils ne créent pas un environnement défavorable ou ne retardent pas la cicatrisation. Des inquiétudes concernant la cytotoxicité de l'argent in vitro ont été rapportées avec plusieurs pansements à base d'argent^10,11. Toutefois, cette cytotoxicité in vitro ne s'est pas encore traduite par une toxicité in vivo, et plusieurs pansements Ag1+ ont démontré un bon profil de sécurité¹².
Nous avons étudié ici l'efficacité de pansements à base de carboxyméthylcellulose contenant de nouvelles formulations d'argent contre le biofilm des plaies, in vitro et in vivo. De plus, nous avons évalué les effets de ces pansements sur les réponses immunitaires et la cicatrisation, indépendamment de toute infection.
Tous les pansements utilisés étaient disponibles dans le commerce. Le pansement 3M Kerracel Gel Fiber (3M, Knutsford, Royaume-Uni), un pansement en fibres de gel de carboxyméthylcellulose (CMC) à 100 % non antimicrobien, a servi de pansement témoin dans cette étude. Trois pansements antimicrobiens à base de CMC et d'argent ont été évalués, notamment le pansement 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Royaume-Uni), qui contient 1,7 % en poids de sel d'argent oxygéné (Ag₇NO₁₁) sous forme d'ions argent de valence supérieure (Ag⁺, Ag²⁺ et Ag³⁺). Lors de la décomposition de Ag₇NO₁₁, les ions Ag⁺, Ag²⁺ et Ag³⁺ sont formés dans un rapport de 1:2:4. Pansement Aquacel Ag Extra contenant 1,2 % de chlorure d'argent (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Royaume-Uni) 13 et pansement Aquacel Ag + Extra contenant 1,2 % de chlorure d'argent (Ag1+), d'EDTA et de chlorure de benzéthonium (ConvaTec, Deeside, Royaume-Uni) 14.
Les souches utilisées dans cette étude étaient Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) et Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Les bactéries ont été cultivées pendant une nuit dans du bouillon Mueller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Royaume-Uni). La culture de la nuit a ensuite été diluée au 1/100e dans du bouillon Mueller-Hinton et 200 µl ont été déposés sur des membranes de cyclopore Whatman stériles de 0,2 µm (Whatman plc, Maidstone, Royaume-Uni) sur des plaques de gélose Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Grande-Bretagne). La formation de biofilms coloniaux a été observée à 37 °C pendant 24 heures. Ces biofilms coloniaux ont été testés pour leur rétrécissement logarithmique.
Découpez le pansement en carrés de 3 cm² et humidifiez-les préalablement avec de l'eau déminéralisée stérile. Appliquez le pansement sur le biofilm de la colonie sur la gélose. Tous les 24 ha, le biofilm a été prélevé et le nombre de bactéries viables (UFC/ml) a été quantifié par dilutions en série (10⁻¹ à 10⁻⁷) dans un bouillon de neutralisation de Day-Angle (Merck-Millipore). Après 24 heures d'incubation à 37 °C, un dénombrement standard a été effectué sur gélose Mueller-Hinton. Chaque traitement et chaque point de mesure ont été réalisés en trois exemplaires, et les dénombrements ont été répétés pour chaque dilution.
La peau de poitrine de porc est obtenue à partir de truies Large White abattues dans les 15 minutes suivant l'abattage, conformément aux normes d'exportation de l'Union européenne. La peau est rasée et nettoyée avec des lingettes alcoolisées, puis congelée à -80 °C pendant 24 heures afin de la dévitaliser. Après décongélation, des fragments de peau de 1 cm² sont lavés trois fois successivement avec du PBS, de l'hypochlorite de sodium à 0,6 % et de l'éthanol à 70 %, pendant 20 minutes à chaque fois. Avant de retirer l'épiderme, toute trace d'éthanol est éliminée par trois lavages successifs dans du PBS stérile. La peau est ensuite mise en culture dans une plaque à 6 puits, recouverte d'une membrane de nylon de 0,45 µm d'épaisseur (Merck-Millipore) et de trois tampons absorbants (Merck-Millipore) contenant 3 ml de sérum de veau fœtal (Sigma) supplémenté avec 10 % de milieu de Dulbecco modifié (DMEM – Aldrich Ltd.).
Des biofilms coloniaux ont été cultivés selon le protocole décrit pour les études d'exposition aux biofilms. Après 72 heures de culture sur membrane, le biofilm a été appliqué sur la surface cutanée à l'aide d'une anse d'inoculation stérile, puis la membrane a été retirée. Le biofilm a ensuite été incubé sur le derme du porc pendant 24 heures supplémentaires à 37 °C afin de permettre sa maturation et son adhésion à la peau. Une fois le biofilm mature et adhérent, un pansement de 1,5 cm², préalablement humidifié avec de l'eau distillée stérile, a été appliqué directement sur la peau et incubé à 37 °C pendant 24 heures. La viabilité bactérienne a été visualisée par coloration au réactif de viabilité cellulaire PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni), appliqué uniformément sur la surface apicale de chaque explant et incubé pendant 5 minutes. Les images ont été capturées instantanément à l'aide de la caméra numérique Leica DFC425 et acquises au microscope Leica MZ8. Les zones colorées en rose ont été quantifiées à l'aide du logiciel Image Pro version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). La microscopie électronique à balayage a été réalisée comme décrit ci-dessous.
Les bactéries cultivées pendant la nuit ont été diluées au 1/100 dans du bouillon Mueller-Hinton. 200 μl de culture ont été déposés sur une membrane stérile Whatman Cyclopore de 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Royaume-Uni) et étalés sur gélose Mueller-Hinton. Les boîtes de Petri contenant le biofilm ont été incubées à 37 °C pendant 72 heures afin de permettre la formation d'un biofilm mature.
Après 3 jours de maturation du biofilm, un pansement carré de 3 cm² a été appliqué directement sur celui-ci et incubé à 37 °C pendant 24 heures. Après retrait du pansement, 1 ml de réactif de viabilité cellulaire PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) a été déposé sur la surface de chaque biofilm pendant 20 secondes. Les surfaces ont ensuite été séchées avant l'enregistrement des changements de couleur à l'aide d'un appareil photo numérique Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Royaume-Uni).
Préparer des cultures de nuit sur gélose Mueller-Hinton, transférer les colonies isolées dans 10 ml de bouillon Mueller-Hinton et incuber sous agitation à 37 °C (100 tr/min). Après une incubation de nuit, diluer la culture au 1/100e dans du bouillon Mueller-Hinton et déposer 300 µl sur une membrane circulaire Whatman Cyclopore de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Royaume-Uni) placée sur gélose Mueller-Hinton. Incuber à 37 °C pendant 72 heures. Le biofilm mature a ensuite été appliqué sur la plaie comme décrit ci-dessous.
Toutes les expériences sur animaux ont été réalisées à l'Université de Manchester, conformément à une autorisation de projet approuvée par le Bureau du bien-être animal et de l'éthique (P8721BD27) et aux directives du ministère de l'Intérieur britannique (Home Office) relatives à la loi ASPA révisée en 2012. Tous les auteurs ont respecté les consignes d'accueil des animaux. Des souris C57BL/6j âgées de huit semaines (Envigo, Oxon, Royaume-Uni) ont été utilisées pour toutes les études in vivo. Les souris ont été anesthésiées à l'isoflurane (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Royaume-Uni), puis leur dos a été rasé et nettoyé. Chaque souris a ensuite subi une excision de 2 × 6 mm à l'aide d'un emporte-pièce de Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Royaume-Uni). Pour les plaies infectées par un biofilm, un biofilm colonial de 72 heures, cultivé sur la membrane comme décrit précédemment, a été appliqué sur le derme de la plaie à l'aide d'une anse d'inoculation stérile, immédiatement après la lésion, puis la membrane a été jetée. Un centimètre carré de pansement est préalablement humidifié avec de l'eau stérile afin de maintenir un milieu humide propice à la cicatrisation. Les pansements sont appliqués directement sur chaque plaie et recouverts d'un film 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Royaume-Uni). De l'adhésif liquide Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, Michigan, États-Unis) est appliqué sur les bords pour une meilleure adhérence. La buprénorphine (Animalcare, York, Royaume-Uni) est administrée à la dose de 0,1 mg/kg comme analgésique. Les souris sont euthanasiées trois jours après la blessure selon la méthode de l'annexe 1 ; la zone de la plaie est prélevée, divisée en deux et conservée selon les besoins.
Les colorations à l'hématoxyline et à l'éosine (ThermoFisher Scientific) ont été réalisées conformément au protocole du fabricant. La surface de la plaie et la réépithélialisation ont été quantifiées à l'aide du logiciel Image Pro version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Les coupes de tissu ont été déparaffinées au xylène (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Royaume-Uni), réhydratées par des bains d'éthanol à concentrations décroissantes (100 % à 50 %) et brièvement immergées dans de l'eau désionisée (ThermoFisher Scientific). L'immunohistochimie a été réalisée à l'aide du kit VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, États-Unis) selon le protocole du fabricant. Les anticorps primaires dirigés contre les neutrophiles (NIMP-R14, Thermofisher Scientific) et les macrophages (Ms CD107b Pure M3/84, BD Biosciences, Wokingham, Royaume-Uni) ont été dilués au 1/100 dans une solution de blocage et déposés sur la surface de coupe. Deux anticorps secondaires (anti-CD107b), le kit VectaStain ABC et le substrat de peroxydase (HRP) Vector Nova Red (Vector Laboratories, Burlingame, CA, États-Unis) ont ensuite été ajoutés, suivis d'une contre-coloration à l'hématoxyline. Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope Olympus BX43 et d'une caméra numérique Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Royaume-Uni).
Les échantillons de peau ont été fixés dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % et de formaldéhyde à 4 % dans du tampon HEPES 0,1 M (pH 7,4) pendant 24 heures à 4 °C. Après déshydratation par des bains d'éthanol de concentration croissante, les échantillons ont été séchés au CO₂ à l'aide d'un séchoir à point critique Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Royaume-Uni) et métallisés par pulvérisation cathodique d'un alliage or-palladium à l'aide d'un mini-pulvérisateur/système de décharge luminescente Quorum SC7620. Les spécimens ont été observés au microscope électronique à balayage FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) afin de visualiser le centre de la plaie.
L'iodure de Toto-1 (2 μM) a été appliqué sur la surface de la plaie excisée de la souris et incubé pendant 5 min à 37 °C (ThermoFisher Scientific), puis traité avec du Syto-60 (10 μM) à 37 °C (ThermoFisher Scientific). Des images en Z (pile d'images) de 15 minutes ont été acquises à l'aide d'un système Leica TCS SP8.
Les données biologiques et techniques des réplicats ont été compilées et analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec comparaisons multiples et test post-hoc de Dunnett a été utilisée pour évaluer les différences entre chaque traitement et le pansement témoin non antimicrobien. Un seuil de signification de p < 0,05 a été retenu.
L'efficacité des pansements fibreux à base de gel d'argent a d'abord été évaluée in vitro sur des biofilms de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa. Ces pansements contiennent différentes formulations d'argent : les pansements traditionnels produisent des ions Ag1+ ; ceux qui, après ajout d'EDTA/BC, produisent des ions Ag1+, détruisent la matrice du biofilm et exposent les bactéries à l'argent grâce à son effet antibactérien ; et ceux contenant des sels d'argent oxygénés produisent des ions Ag1+, Ag2+ et Ag3+. Leur efficacité a été comparée à celle d'un pansement témoin non antimicrobien, composé de fibres gélifiées. Le nombre de bactéries viables restantes au sein du biofilm a été évalué toutes les 24 heures pendant 8 jours (Figure 1). Au 5e jour, le biofilm a été réinoculé avec 3,85 × 10⁵ Staphylococcus aureus ou 1,22 × 10⁵ P. aeruginosa afin d'évaluer sa reconstitution. Comparativement aux pansements témoins non antimicrobiens, les pansements Ag1+ ont eu un effet minimal sur la viabilité bactérienne des biofilms de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa sur une période de 5 jours. En revanche, les pansements contenant de l'argent oxygéné et des sels Ag1+ + EDTA/BC se sont avérés efficaces pour éliminer les bactéries au sein du biofilm en 5 jours. Après inoculation répétée avec des bactéries planctoniques au 5e jour, aucune restauration du biofilm n'a été observée (Fig. 1).
Quantification des bactéries viables dans les biofilms de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa après traitement par pansements à l'argent. Des colonies de biofilms de Staphylococcus aureus et de Pseudomonas aeruginosa ont été traitées avec des pansements à l'argent ou des pansements témoins non antimicrobiens, et le nombre de bactéries viables restantes a été déterminé toutes les 24 heures. Après 5 jours, le biofilm a été réinoculé avec 3,85 × 10⁵ Staphylococcus aureus ou 1,22 × 10⁵ P. Des colonies du bactérioplancton Pseudomonas aeruginosa ont été formées individuellement pour évaluer la régénération du biofilm. Les graphiques représentent la moyenne ± l'erreur standard.
Pour visualiser l'effet des pansements à base d'argent sur la viabilité des biofilms, ces pansements ont été appliqués sur des biofilms matures cultivés ex vivo sur de la peau de porc. Après 24 heures, le pansement est retiré et le biofilm est coloré avec un colorant réactif bleu, métabolisé en rose par les bactéries vivantes. Les biofilms traités avec les pansements témoins étaient roses, indiquant la présence de bactéries viables au sein du biofilm (Figure 2A). En revanche, le biofilm traité avec le pansement à base d'oxysols d'argent était principalement bleu, indiquant que les bactéries restantes à la surface de la peau du porc étaient non viables (Figure 2B). Une coloration mixte bleue et rose a été observée dans les biofilms traités avec les pansements contenant des ions Ag¹⁺, indiquant la présence de bactéries viables et non viables au sein du biofilm (Figure 2C), tandis que les pansements EDTA/BC contenant des ions Ag¹⁺ étaient majoritairement bleus avec quelques taches roses, indiquant des zones non affectées par le pansement à base d'argent (Figure 2D). La quantification des zones actives (rose) et inactives (bleu) a montré que le pansement témoin était actif à 75 % (Figure 2E). Les pansements Ag1+ + EDTA/BC ont présenté des performances similaires aux pansements au sel d'argent oxygéné, avec des taux de survie respectifs de 13 % et 14 %. Le pansement Ag1+ a également réduit la viabilité bactérienne de 21 %. Ces biofilms ont ensuite été observés par microscopie électronique à balayage (MEB). Après traitement avec le pansement témoin et le pansement Ag1+, une couche de Pseudomonas aeruginosa recouvrait la peau de porc (Figure 2F, H), tandis qu'après traitement avec le pansement Ag1+, seules quelques cellules bactériennes ont été observées, de préférence en dessous. Les fibres de collagène constituent la structure tissulaire de la peau de porc (Figure 2G). Après traitement avec le pansement Ag1+ + EDTA/BC, des plaques bactériennes et des plaques de fibres de collagène sous-jacentes étaient visibles (Figure 2I).
Visualisation du biofilm de Pseudomonas aeruginosa après traitement par pansement à l'argent. (A–D) La viabilité bactérienne des biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivés sur peau de porc a été visualisée à l'aide du colorant de viabilité PrestoBlue 24 heures après traitement par pansements à l'argent ou par pansements témoins non antimicrobiens. Les bactéries vivantes apparaissent en rose, les bactéries non viables et la peau de porc en bleu. (E) Quantification des biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivés sur peau de porc (tache rose) par microscopie électronique à balayage (MEB) Image Pro version 10 (FI) et traités par pansement à l'argent ou par pansement témoin non antimicrobien pendant 24 heures. Échelle MEB : 5 µm. (J–M) Les biofilms coloniaux cultivés sur filtres ont été colorés au colorant réactif PrestoBlue après 24 h d'incubation avec les pansements à l'argent.
Pour déterminer si le contact étroit entre les pansements et les biofilms affectait l'efficacité de ces derniers, des biofilms coloniaux déposés sur une surface plane ont été traités avec les pansements pendant 24 heures, puis colorés à l'aide de colorants réactifs. Le biofilm non traité était de couleur rose foncé (Figure 2J). Contrairement aux biofilms traités avec des pansements contenant des sels d'argent oxygénés (Figure 2K), les biofilms traités avec des pansements contenant Ag¹⁺ ou Ag¹⁺ + EDTA/BC présentaient des bandes de coloration rose (Figure 2L,M). Cette coloration rose indique la présence de bactéries viables et est associée à la zone de suture au sein du pansement. Ces zones suturées créent des espaces morts qui permettent la survie des bactéries présentes dans le biofilm.
Pour évaluer l'efficacité des pansements à base d'argent in vivo, des plaies excisées de pleine épaisseur chez des souris infectées par des biofilms matures de S. aureus et de P. aeruginosa ont été traitées avec des pansements témoins non antimicrobiens ou des pansements à base d'argent. Après 3 jours de traitement, l'analyse d'images macroscopiques a révélé des plaies plus petites avec les pansements salins oxygénés qu'avec les pansements témoins non antimicrobiens et les autres pansements à base d'argent (Figure 3A-H). Afin de confirmer ces observations, les plaies ont été prélevées et leur surface ainsi que la réépithélialisation ont été quantifiées sur des coupes tissulaires colorées à l'hématoxyline-éosine à l'aide du logiciel Image Pro version 10 (Figure 3I-L).
Effet des pansements à base d'argent sur la surface des plaies et la réépithélialisation des plaies infectées par des biofilms. (A–H) Petites cellules infectées par des biofilms de Pseudomonas aeruginosa (A–D) et de Staphylococcus aureus (E–H) après trois jours de traitement avec un pansement témoin non antimicrobien, un pansement à base de sel d'argent oxygéné, un pansement Ag1+ et un pansement Ag1+. Images macroscopiques représentatives. Plaies de souris avec un pansement Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infection représentative à Pseudomonas aeruginosa : coupes histologiques colorées à l'hématoxyline-éosine, utilisées pour quantifier la surface de la plaie et la régénération épithéliale. Quantification de la surface de la plaie (M, O) et du pourcentage de réépithélialisation (N, P) des plaies infectées par des biofilms de Pseudomonas aeruginosa (M, N) et de Staphylococcus aureus (O, P) (n = 12 par groupe de traitement). Les graphiques montrent la moyenne ± l'erreur standard. * signifie p < 0,05 ** signifie p < 0,01 ; Échelle macroscopique = 2,5 mm, échelle histologique = 500 µm.
La quantification de la surface des plaies infectées par un biofilm de Pseudomonas aeruginosa (Figure 3M) a montré que les plaies traitées avec des oxysels d'argent présentaient une surface moyenne de 2,5 mm², tandis que le pansement témoin non antimicrobien présentait une surface moyenne de 3,1 mm², ce qui n'est pas statistiquement significatif (Figure 3M, p = 0,423). Les plaies traitées avec Ag⁺ ou Ag⁺ + EDTA/BC n'ont montré aucune réduction de leur surface (3,1 mm² et 3,6 mm², respectivement). Le traitement avec un pansement aux sels d'argent oxygénés a favorisé la réépithélialisation de manière plus importante que le pansement témoin non antimicrobien (34 % et 15 %, respectivement ; p = 0,029) et que Ag⁺ ou Ag⁺ + EDTA/BC (10 % et 11 %, respectivement) (Figure 3N).
Des tendances similaires concernant la surface de la plaie et la régénération épithéliale ont été observées dans les plaies infectées par des biofilms de S. aureus (Figure 3O). Les pansements contenant des sels d'argent oxygénés ont réduit la surface de la plaie (2,0 mm²) de 23 % par rapport au pansement témoin non antimicrobien (2,6 mm²), bien que cette réduction ne soit pas significative (p = 0,304) (Figure 3O). De plus, la surface de la plaie dans le groupe traité par Ag⁺ a légèrement diminué (2,4 mm²), tandis que la plaie traitée avec le pansement Ag⁺ + EDTA/BC n'a pas présenté de réduction de surface (2,9 mm²). Les sels d'argent oxygénés ont également favorisé la réépithélialisation des plaies infectées par un biofilm de S. aureus (31 %) de manière plus importante que celles traitées avec les pansements témoins non antimicrobiens (12 %, p = 0,003) (Figure 3P). Le pansement Ag1+ (16 %, p = 0,903) et le pansement Ag+1 + EDTA/BC (14 %, p = 0,965) ont montré des niveaux de régénération épithéliale similaires au contrôle.
Pour visualiser l'effet des pansements à base d'argent sur la matrice du biofilm, une coloration au Toto 1 et à l'iodure de Syto 60 a été réalisée (Fig. 4). L'iodure de Toto 1 est un colorant imperméable aux cellules, permettant de visualiser avec précision les acides nucléiques extracellulaires, abondants dans la matrice extracellulaire (EPS) des biofilms. Le Syto 60 est un colorant perméable aux cellules, utilisé comme contre-colorant¹⁶. L'observation des pansements au Toto 1 et à l'iodure de Syto 60 sur des plaies inoculées avec des biofilms de Pseudomonas aeruginosa (Figure 4A-D) et de Staphylococcus aureus (Figure 4I-L) a montré qu'après 3 jours de traitement, la quantité d'EPS dans le biofilm était significativement réduite. Les pansements Ag1+ sans composants antibiofilm supplémentaires ont réduit de manière significative l'ADN acellulaire dans les plaies inoculées avec Pseudomonas aeruginosa, mais se sont avérés moins efficaces dans les plaies inoculées avec Staphylococcus aureus.
Imagerie in vivo du biofilm de la plaie après 3 jours de traitement avec des pansements témoins ou à l'argent. Images confocales de Pseudomonas aeruginosa (A–D) et de Staphylococcus aureus (I–L) colorées au Toto 1 (vert) pour visualiser les acides nucléiques extracellulaires, composants des polymères du biofilm extracellulaire. Pour colorer les acides nucléiques intracellulaires, utiliser le Syto 60 (rouge). Microscopie électronique à balayage de plaies infectées par des biofilms de Pseudomonas aeruginosa (E–H) et de Staphylococcus aureus (M–P) après 3 jours de traitement avec des pansements témoins ou à l'argent. Échelle MEB : 5 µm. Échelle imagerie confocale : 50 µm.
La microscopie électronique à balayage a montré que les souris inoculées avec des colonies de biofilm de Pseudomonas aeruginosa (Figure 4E-H) et de Staphylococcus aureus (Figure 4M-P) avaient significativement moins de bactéries dans leurs plaies après 3 jours de traitement avec tous les pansements à l'argent.
Afin d'évaluer l'effet des pansements à base d'argent sur l'inflammation des plaies chez des souris infectées par un biofilm, des sections de plaies infectées par un biofilm et traitées pendant 3 jours avec des pansements témoins ou à base d'argent ont été colorées par immunohistochimie à l'aide d'anticorps spécifiques des neutrophiles et des macrophages. Le nombre de neutrophiles et de macrophages a été déterminé quantitativement au sein du tissu de granulation (Figure 5). Tous les pansements à base d'argent ont réduit le nombre de neutrophiles et de macrophages dans les plaies infectées par Pseudomonas aeruginosa, comparativement aux pansements témoins non antimicrobiens, après trois jours de traitement. Cependant, le traitement avec le pansement au sel d'argent oxygéné a entraîné une réduction plus importante du nombre de neutrophiles (p < 0,0001) et de macrophages (p < 0,0001) comparativement aux autres pansements à base d'argent testés (Figure 5I, J). Bien que le pansement Ag1+ + EDTA/BC ait eu un effet plus marqué sur le biofilm de la plaie, il a réduit les taux de neutrophiles et de macrophages dans une moindre mesure que le pansement Ag1+. Des plaies modérées infectées par un biofilm de S. aureus ont également été observées après application de pansements contenant des oxisols d'Ag (p < 0,0001), d'Ag1+ (p = 0,0008) et d'Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043), comparativement au groupe témoin. Des tendances similaires ont été observées pour la neutropénie. Cependant, seul le pansement au sel d'Ag oxygéné a montré une réduction significative du nombre de macrophages dans le tissu de granulation, comparativement au groupe témoin, pour les plaies infectées par des biofilms de S. aureus (p = 0,0339) (Figure 5L).
Les neutrophiles et les macrophages ont été quantifiés dans des plaies infectées par des biofilms de Pseudomonas aeruginosa et de Staphylococcus aureus après 3 jours de traitement avec un pansement témoin non antimicrobien ou un pansement à l'argent. Les neutrophiles (AD) et les macrophages (EH) ont été quantifiés dans des coupes tissulaires colorées avec des anticorps spécifiques des neutrophiles ou des macrophages. Quantification des neutrophiles (I et K) et des macrophages (J et L) dans des plaies infectées par des biofilms de Pseudomonas aeruginosa (I et J) et de Staphylococcus aureus (K et L). N = 12 par groupe. Les graphiques représentent la moyenne ± l'erreur standard. Les valeurs de signification sont comparées au pansement témoin non antibactérien. * signifie p < 0,05, ** signifie p < 0,01 ; *** signifie p < 0,001 ; < 0,0001.
Nous avons ensuite évalué l'effet des pansements à base d'argent sur la cicatrisation indépendante de l'infection. Des plaies d'excision non infectées ont été traitées pendant 3 jours avec un pansement témoin non antimicrobien ou un pansement à base d'argent (Figure 6). Parmi les pansements à base d'argent testés, seules les plaies traitées avec le pansement salin oxygéné présentaient une surface plus petite sur les images macroscopiques que celles traitées avec le pansement témoin (Figure 6A-D). La quantification de la surface des plaies par analyse histologique a montré que la surface moyenne des plaies après traitement avec le pansement à base d'oxysol d'argent était de 2,35 mm² contre 2,96 mm² pour les plaies du groupe témoin, mais cette différence n'était pas statistiquement significative (p = 0,488) (Figure 6I). En revanche, aucune réduction de la surface des plaies n'a été observée après traitement avec les pansements Ag1+ (3,38 mm², p = 0,757) ou Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm², p = 0,054) par rapport au groupe témoin. Une régénération épithéliale accrue a été observée avec le pansement Ag oxysol par rapport au groupe témoin (30 % vs 22 %, respectivement). Bien que cette différence ne soit pas statistiquement significative (p = 0,067), elle reste néanmoins significative et confirme des résultats antérieurs. Un pansement à base d'oxysols favorise la réépithélialisation des plaies non infectées¹⁷. En revanche, les pansements Ag¹⁺ ou Ag¹⁺ + EDTA/BC n'ont eu aucun effet ou ont montré une réépithélialisation diminuée par rapport au groupe témoin.
Effet d'un pansement à base d'argent sur la cicatrisation des plaies chez des souris non infectées ayant subi une résection complète. (AD) Images macroscopiques représentatives des plaies après trois jours de traitement avec un pansement témoin non antimicrobien et un pansement à base d'argent. (EH) Coupes histologiques représentatives des plaies colorées à l'hématoxyline-éosine. La surface de la plaie (I) et le pourcentage de réépithélialisation (J) ont été quantifiés à partir de coupes histologiques réalisées au milieu de la plaie à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images (n = 11–12 par groupe de traitement). Les graphiques représentent la moyenne ± l'erreur standard. * p < 0,05.
L'argent est utilisé depuis longtemps comme traitement antimicrobien pour la cicatrisation des plaies, mais la diversité des formulations et des modes d'administration peut entraîner des variations d'efficacité antimicrobienne¹⁸. De plus, les propriétés antibiofilm des différents systèmes d'administration d'argent restent mal connues. Bien que la réponse immunitaire de l'hôte soit relativement efficace contre les bactéries planctoniques, elle l'est généralement moins contre les biofilms¹⁹. Les bactéries planctoniques sont facilement phagocytées par les macrophages, mais au sein des biofilms, l'agrégation cellulaire pose problème en limitant la réponse de l'hôte, au point que les cellules immunitaires peuvent subir l'apoptose et libérer des facteurs pro-inflammatoires pour renforcer la réponse immunitaire²⁰. Il a été observé que certains leucocytes peuvent pénétrer les biofilms²¹ mais sont incapables de phagocyter les bactéries une fois cette défense compromise²². Une approche globale est donc nécessaire pour soutenir la réponse immunitaire de l'hôte contre l'infection par biofilm de la plaie. Le débridement de la plaie permet de désagréger physiquement le biofilm et d'éliminer la majeure partie de la charge bactérienne, mais la réponse immunitaire de l'hôte peut s'avérer inefficace contre le biofilm résiduel, notamment si elle est affaiblie. Ainsi, les traitements antimicrobiens tels que les pansements à base d'argent peuvent stimuler la réponse immunitaire de l'hôte et éliminer les infections à biofilm. La composition, la concentration, la solubilité et le support d'application peuvent influencer l'efficacité antimicrobienne de l'argent. Ces dernières années, les progrès réalisés dans les techniques de traitement de l'argent ont permis d'améliorer l'efficacité de ces pansements^9,23. Face à l'évolution des technologies de pansements à base d'argent, il est essentiel de comprendre leur efficacité dans la maîtrise des infections de plaies et, surtout, l'impact de ces formes puissantes d'argent sur l'environnement de la plaie et la cicatrisation.
Dans cette étude, nous avons comparé l'efficacité de deux pansements à l'argent de pointe à celle de pansements à l'argent conventionnels produisant des ions Ag1+ contre les biofilms, en utilisant différents modèles in vitro et in vivo. Nous avons également évalué l'effet de ces pansements sur l'environnement de la plaie et la cicatrisation indépendante de l'infection. Afin de minimiser l'influence de la matrice de libération, tous les pansements à l'argent testés étaient composés de carboxyméthylcellulose.
Notre évaluation préliminaire de ces pansements à base d'argent contre les biofilms coloniaux de Pseudomonas aeruginosa et de Staphylococcus aureus montre que, contrairement aux pansements Ag1+ traditionnels, deux pansements à base d'argent de pointe, Ag1+ + EDTA/BC et les sels d'argent oxygénés, sont efficaces pour éliminer les bactéries du biofilm en quelques jours. De plus, ces pansements empêchent la reformation du biofilm lors d'expositions répétées aux bactéries planctoniques. Le pansement Ag1+ contenait du chlorure d'argent, le même composé d'argent et la même matrice de base que le pansement Ag1+ + EDTA/BC, et a eu un effet limité sur la viabilité bactérienne au sein du biofilm pendant la même période. L'observation qu'un pansement Ag1+ + EDTA/BC était plus efficace contre le biofilm qu'un pansement Ag1+ composé de la même matrice et d'un composé d'argent confirme l'idée que des ingrédients supplémentaires sont nécessaires pour augmenter l'efficacité du chlorure d'argent contre le biofilm, comme cela a été rapporté ailleurs¹⁵. Ces résultats confirment l'hypothèse selon laquelle la cellulose bactérienne (BC) et l'EDTA contribuent à l'efficacité globale des pansements et que l'absence de ce composant dans les pansements Ag1+ pourrait expliquer l'absence d'efficacité démontrée in vitro. Nous avons constaté que les pansements à base de sels d'argent oxygénés, produisant des ions Ag2+ et Ag3+, présentaient une efficacité antibactérienne supérieure à celle des pansements Ag1+ et comparable à celle des pansements Ag1+ + EDTA/BC. Cependant, en raison du potentiel redox élevé, la durée d'activité et d'efficacité des ions Ag3+ contre les biofilms des plaies reste incertaine et mérite donc d'être étudiée plus en détail. Par ailleurs, de nombreux pansements générant des ions Ag1+ n'ont pas été testés dans cette étude. Ces pansements sont composés de différents composés d'argent, présentent des concentrations variables et sont constitués de matrices de base différentes, ce qui peut influencer la libération des ions Ag1+ et leur efficacité contre les biofilms. Il convient également de noter la diversité des modèles in vitro et in vivo utilisés pour évaluer l'efficacité des pansements contre les biofilms. Le type de modèle utilisé, ainsi que la teneur en sel et en protéines du milieu de culture, influencent l'efficacité du pansement. Dans notre modèle in vivo, nous avons laissé le biofilm maturer in vitro avant de le transférer sur la surface cutanée de la plaie. La réponse immunitaire de la souris hôte est relativement efficace contre les bactéries planctoniques appliquées sur la plaie, ce qui entraîne la formation d'un biofilm lors de la cicatrisation. L'ajout d'un biofilm mature à une plaie limite l'efficacité de la réponse immunitaire de l'hôte à sa formation, car le biofilm mature a le temps de s'établir au sein de la plaie avant même que la cicatrisation ne puisse commencer. Ainsi, notre modèle nous permet d'évaluer l'efficacité des pansements antimicrobiens sur les biofilms matures avant le début de la cicatrisation.
Nous avons également constaté que l'ajustement du pansement influençait l'efficacité des pansements à base d'argent sur les biofilms cultivés in vitro et sur la peau porcine. Un contact étroit avec la plaie est considéré comme essentiel à l'efficacité antimicrobienne du pansement^24,25. Les pansements contenant des sels d'argent oxygénés étaient en contact étroit avec les biofilms matures, ce qui a entraîné une réduction significative du nombre de bactéries viables au sein du biofilm après 24 heures. En revanche, avec les pansements Ag¹⁺ et Ag¹⁺ + EDTA/BC, un nombre important de bactéries viables persistait. Ces pansements comportent des sutures sur toute leur longueur, créant des espaces morts qui empêchent un contact étroit avec le biofilm. Dans nos études in vitro, ces zones de non-contact ont empêché l'élimination des bactéries viables au sein du biofilm. Nous avons évalué la viabilité bactérienne uniquement après 24 heures de traitement ; avec le temps, à mesure que le pansement se sature, les espaces morts peuvent diminuer, réduisant ainsi la surface disponible pour ces bactéries viables. Cependant, cela souligne l'importance de la composition du pansement, et pas seulement du type d'argent qu'il contient.
Bien que les études in vitro soient utiles pour comparer l'efficacité des différentes technologies à base d'argent, il est également important de comprendre les effets de ces pansements sur les biofilms in vivo, où les tissus hôtes et les réponses immunitaires contribuent à leur efficacité contre les biofilms. L'effet de ces pansements sur les biofilms des plaies a été observé par microscopie électronique à balayage et coloration EPS du biofilm à l'aide de colorants d'ADN intracellulaire et extracellulaire. Nous avons constaté qu'après 3 jours de traitement, tous les pansements étaient efficaces pour réduire l'ADN acellulaire dans les plaies infectées par un biofilm, mais le pansement Ag1+ était moins efficace dans les plaies infectées par Staphylococcus aureus. La microscopie électronique à balayage a également montré une réduction significative du nombre de bactéries dans les plaies traitées avec les pansements à base d'argent, réduction plus marquée avec le pansement au sel d'argent oxygéné et le pansement Ag1+ + EDTA/BC qu'avec le pansement Ag1+. Ces données montrent que les pansements à l'argent testés ont eu un impact variable sur la structure du biofilm, mais aucun n'a permis de l'éradiquer, ce qui souligne la nécessité d'une approche globale pour le traitement des infections de plaies à biofilm ; l'utilisation de bracelets d'argent est une option. Le traitement est précédé d'un débridement physique afin d'éliminer la majeure partie du biofilm.
Les plaies chroniques présentent souvent une inflammation sévère, avec un excès de cellules inflammatoires persistant dans les tissus pendant une période prolongée. Ceci entraîne des lésions tissulaires et une privation d'oxygène nécessaire au bon fonctionnement et au métabolisme cellulaire²⁶. Les biofilms aggravent cet environnement hostile en affectant négativement la cicatrisation de diverses manières, notamment en inhibant la prolifération et la migration cellulaires et en activant les cytokines pro-inflammatoires²⁷. À mesure que les pansements à base d'argent gagnent en efficacité, il est important de comprendre leur impact sur l'environnement de la plaie et la cicatrisation.
Il est intéressant de noter que, bien que tous les pansements à base d'argent aient influencé la composition du biofilm, seuls les pansements aux sels d'argent oxygénés ont favorisé la réépithélialisation de ces plaies infectées. Ces données confirment nos résultats antérieurs¹⁷ et ceux de Kalan et al. (2017)²⁸, qui ont démontré le bon profil de sécurité et de toxicité des sels d'argent oxygénés, de faibles concentrations d'argent s'avérant efficaces contre les biofilms.
Notre étude actuelle met en évidence les différences de technologie de l'argent entre les pansements antimicrobiens à base d'argent et l'impact de cette technologie sur l'environnement de la plaie et la cicatrisation indépendante de l'infection. Cependant, ces résultats diffèrent d'études antérieures montrant qu'un pansement Ag1+ + EDTA/BC améliorait les paramètres de cicatrisation des oreilles de lapin blessées in vivo. Cette différence pourrait toutefois être due à des variations dans les modèles animaux, les délais de mesure et les méthodes d'application bactérienne²⁹. Dans notre étude, les mesures de la plaie ont été effectuées 12 jours après la blessure afin de permettre aux principes actifs du pansement d'agir sur le biofilm sur une période plus longue. Ceci est corroboré par une étude montrant que les ulcères de jambe infectés cliniquement, traités avec Ag1+ + EDTA/BC, augmentaient initialement de taille après une semaine de traitement, puis diminuaient au cours des 3 semaines suivantes de traitement avec Ag1+ + EDTA/BC et dans les 4 semaines suivant l'utilisation de pansements CMC non antimicrobiens pour réduire la taille des ulcères³⁰.
Il a été démontré que certaines formes et concentrations d'argent sont cytotoxiques in vitro¹¹, mais ces résultats in vitro ne se traduisent pas toujours par des effets indésirables in vivo. Par ailleurs, les progrès technologiques concernant l'argent et une meilleure compréhension des composés et des concentrations d'argent dans les pansements ont permis le développement de nombreux pansements à base d'argent sûrs et efficaces. Cependant, à mesure que cette technologie évolue, il est important de comprendre l'impact de ces pansements sur l'environnement de la plaie^31,32,33. Il a été précédemment rapporté que l'augmentation du taux de réépithélialisation correspond à une proportion accrue de macrophages M2 anti-inflammatoires par rapport au phénotype M1 pro-inflammatoire. Ce phénomène a été observé dans un modèle murin antérieur où des pansements hydrogels à base d'argent ont été comparés à des pansements à base de sulfadiazine d'argent et à des hydrogels non antimicrobiens³⁴.
Les plaies chroniques peuvent présenter une inflammation excessive et il a été observé qu'un excès de neutrophiles peut nuire à la cicatrisation³⁵. Dans une étude menée sur des souris dépourvues de neutrophiles, la présence de ces derniers a retardé la réépithélialisation. Un excès de neutrophiles entraîne une augmentation des taux de protéases et d'espèces réactives de l'oxygène, telles que le superoxyde et le peroxyde d'hydrogène, associées aux plaies chroniques et à cicatrisation lente^37,38. De même, une augmentation non contrôlée du nombre de macrophages peut retarder la cicatrisation³⁹. Cette augmentation est particulièrement importante si les macrophages sont incapables de passer d'un phénotype pro-inflammatoire à un phénotype pro-cicatrisant, empêchant ainsi la plaie de sortir de la phase inflammatoire⁴⁰. Nous avons observé une diminution du nombre de neutrophiles et de macrophages dans les plaies infectées par un biofilm après 3 jours de traitement avec tous les pansements à base d'argent, mais cette diminution était plus marquée avec les pansements salins oxygénés. Cette diminution pourrait être une conséquence directe de la réponse immunitaire à l'argent, une réponse à une réduction de la charge bactérienne, ou encore le fait que la plaie soit à un stade plus avancé de cicatrisation, entraînant ainsi une diminution du nombre de cellules immunitaires. La réduction du nombre de cellules inflammatoires dans la plaie pourrait maintenir un environnement propice à la cicatrisation. Le mécanisme d'action par lequel les oxysels d'argent favorisent une cicatrisation indépendante de l'infection reste incertain, mais leur capacité à produire de l'oxygène et à neutraliser les niveaux nocifs de peroxyde d'hydrogène, un médiateur de l'inflammation, pourrait l'expliquer et mérite d'être étudiée plus en détail¹⁷.
Les plaies infectées chroniques qui ne cicatrisent pas constituent un problème tant pour les médecins que pour les patients. Bien que de nombreux pansements revendiquent une efficacité antimicrobienne, la recherche s'intéresse rarement aux autres facteurs clés influençant le microenvironnement de la plaie. Cette étude montre que différentes technologies à base d'argent présentent une efficacité antimicrobienne variable et, surtout, des effets différents sur l'environnement de la plaie et la cicatrisation, indépendamment de l'infection. Bien que ces études in vitro et in vivo démontrent l'efficacité de ces pansements dans le traitement des infections et la promotion de la cicatrisation, des essais contrôlés randomisés sont nécessaires pour évaluer leur efficacité en pratique clinique.
Les jeux de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.